MTT实验操作流程

MTT 实验标准操作流程实验标准操作流程 1 原理原理 活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒 Formazan 并沉积在细胞中 而死细胞无此功能 二甲基亚砜 DMSO 能溶解细胞中的 甲瓒 用酶标仪在 570nm 波长处测定其光吸收值 在一定细胞数范围内 MTT 结晶形成的 量与细胞数成正比 根据测得的吸光度值 即 OD 值 来判断活细胞数量 OD 值越大 细胞活性越强 如果是测药物毒性 则表示药物毒性越小 2 试剂及耗材试剂及耗材 CO2细胞培养箱 生物安全柜 倒置显微镜 低速离心机 酶标仪 8道排枪 培养基 胎牛血清 MTT DMSO 96孔细胞培养板 胰酶 血细胞计数板 3 注意事项注意事项 MTT溶液的配制 通常MTT 配成的终浓度为5mg ml 须用PBS或生理盐水做溶剂 MTT 一般最好现用现配 0 22 m过滤后4 避光保存两周内 或配制成5mg ml保存在 20 长期 保存 避免反复冻融 小剂量分装 用避光袋或锡箔纸包住避光以免分解 当MTT变为灰绿 色时不能再用 DMSO可以直接溶解 无需配制 使用方便 溶解速度快 但对人体毒性较大 且需去 除原培养液 在去除培养液的过程中 可能会把结晶去掉 导致结果不稳定 4 实验步骤 实验步骤 4 1 细胞标准曲线制作细胞标准曲线制作 4 1 1 0 5 的胰酶消化对数期细胞 待细胞即将脱离皿底时 加少量血清终止反应 1000r min 离心 5min 吸去上清 将细胞沉淀用培养基吹打混匀 制成细胞悬液 细胞计 数后调整其浓度至 5 10 104 ml 4 1 2 取4块96孔板 分别标记为0h 24h 48h 72h 每组设置3个复孔 每孔加入100 L细胞悬液 每板分别铺8组细胞 分别为 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000个 孔 边缘孔用无菌PBS填充以 消除边缘效应 4 1 3 5 CO2 37 培养箱继续培养 每24 h取出一块96孔板检测 a 每孔加入10 L MTT溶液 5mg ml 继续细胞培养箱培养4 6h b 小心吸去孔内培养液 c 每孔加入150 L DMSO 使结晶物充分溶解 d 加DMSO后10min内 用酶标仪检测各孔波长 l570nm的吸光值 4 1 4 标准曲线制作 以时间为横坐标 吸光度值为纵坐标绘制细胞增殖标准曲线 选择合适的细胞浓度进行实验 4 2 MTT 药物毒性实验步骤药物毒性实验步骤 4 2 1 0 5 的胰酶消化对数期细胞 加少量血清终止反应 1000r min 离心 5min 吸去上 清 将细胞沉淀用培养基吹打混匀 制成细胞悬液 细胞计数后调整其浓度至 5 10 104 ml 药物毒性实验一般每孔细胞数量 5000 10000 个 具体数目根据预实验判断 此外 还应根据细胞本身特性 如生长快慢 来决定细胞数量 比如 生长较快的细胞密度 可略小 4 2 2 将细胞悬液制备好后 轻轻混匀 每孔加入 90 l 细胞悬液 这样待测细胞的密度为 5000 10000 孔 边缘孔用无菌 PBS 填充 注意 因细胞在混匀后仍要继续沉降 因此接种的过程中要反复多次混匀 如每加 5 个孔就 混匀一次 以确保接种的细胞密 在各孔之间完全相同 这对于 MTT 的结果至关重要 4 2 3 5 CO2 37 培养箱继续培养 待细胞单层铺满孔底 96 孔平底板 加入浓度梯度 的药物 原则上 细胞贴壁后即可加药 或两 h 或半天时间 但我们常在前一天下午铺 板 次日上午加药 加药时按照所需的浓度在 EP 管中先稀释好 每孔加入 10 l 已经稀释好 药物 使每孔最终体积为 100 l 为了避免产生误差 稀释好的药物体积应略大于所需药物 的体积 需要注意的是 以 DMSO 作为溶剂溶解的药物至少需要进行 100 倍以上稀释才能 使用 因为作用于细胞 DMSO 的含量高于 1 时 DMSO 会杀死细胞从而影响判断 4 2 4 按照药物作用时间点 每24 h取出一块96孔板检测 a 每孔加入10 L MTT溶液 5mg ml 继续细胞培养箱培养4 6h b 小心吸去孔内培养液 c 每孔加入150 L DMSO 置摇床上低速振荡10min 使结晶物充分溶解 d 加DMSO后10min内 用酶标仪检测各孔波长570nm的吸光值 4 2 5 同时设置调零孔 培养基 MTT 二甲基亚砜 对照孔 细胞 相同浓度的药物溶解 介质 培养液 MTT 二甲基亚砜 4 2 6 MTT 结果分析 IC50 值可以通过 Graphpad prism5 进行计算 4 3 MTT 增殖实验增殖实验 4 3 1 分别收集各组对数期的细胞 调整细胞悬液浓度 4 3 2 取4块96孔板 每孔加入100 L细胞悬液 铺板使待测细胞为5 103 cell 孔 边缘孔用 无菌PBS填充以消除边缘效应 每组设置3个复孔 4 3 3 5 CO2 37 培养箱继续培养 每24 h取出一块96孔板检测 a 每孔加入20 L MTT溶液 5