酶免疫技术

第九章 酶免疫技术,目的要求,一、酶免疫技术： 是以酶标记的抗体（抗原）作为主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶的高效催化反应的专一性相结合的一种免疫检测技术,第一节 概 述,三大经典标记技术之一,Ag -Ab-E (Ag-E -Ab),S,显色反应,Ag (Ab)定性、定量 、定位分析,基本原理,Ab-E(Ag-E ) + Ag (Ab),酶免疫技术的特点,灵敏度高、特异性强、准确性好酶标记试剂能够较长时间保持稳定操作简便、对环境没有污染。易与其它技术偶联，衍生出适用范围更广的新方法。影响被标记物天然构象,酶免疫技术,固相酶免疫测定,液相酶免疫测定,均相酶免疫测定,非均相酶免疫测定,二、技术分类,第二节、酶标记物的制备,（一）标记酶的要求： 1.活性高 2.性质稳定 3.专一性强 4.酶催化底物的显色信号易于判断和测量 5.方法敏感，重复性好，简单易行 6.酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉,（一）辣根过氧化物酶 （horseradish peroxidase ,HRP）,2.糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心,3.酶纯度(RZ值)： 403nm(辅基)与275nm(主酶)OD值之比。 HRP RZ3,5.RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要,1.ELISA中应用最为广泛的标记用酶,4.酶活性单位(U): 在特定条件（25，其它为最适条件）下，1分钟将1微摩底物转化为产物所需的酶量。 HRP 250U/mg,DH2十H2O2D十2H20,HRP催化的反应式为：,DH2为供氢体，习惯称为底物，H2O2为受氢体,HRP对受氢体的专一性很高，作用底物有多种。,HRP常用的供氢体底物及其特性,（二）碱性磷酸酶 （alkaline phosphatase，AP),是一种磷酸酯水解酶，从大肠杆菌提取,AP的 底物,对-硝基苯磷酸酯（ pNPP ）,经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405 nm。,三、酶标抗体(抗原)的制备,制备要求：,抗原要求纯度高、抗原性强。,抗体则要求特异性强、效价高、亲和力强、易于分离纯化和批量生产。,（一）常用的标记方法,标记方法要求：,方法简单，产率高不影响酶和抗体(抗原)的生物活性所得酶结合物稳定，本身不发生聚合较少形成酶与酶、抗体与抗体或抗原与抗原的 聚合物,1过碘酸钠氧化法,常用于HRP的标记。过碘酸钠将多糖羟基氧化为醛基，可与抗体蛋白的游离氨基结合，形成HRP-CH2-NH-IgG。,优点：此法酶标记物产率较高，常用HRP标记。缺点：只适合含多糖的酶，具有局限性；,方法学评价：,2戊二醛交联法,戊二醛分子中有两个相同的醛基，作为“桥梁”，可分别与酶和抗体（抗原）分子上的氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。,优点：适合各种酶蛋白标记。标记反应温和缺点：标记产率低，且酶和抗体易出现自联，抗体的活性可能有所降低,方法学评价：,（二）酶标记物的纯化与鉴定,1酶标记物的纯化,标记完成后应除去反应溶液中的游离酶、游离抗体(抗原)、酶聚合物及抗体(抗原)聚合物，避免游离酶增加非特异显色以及游离抗体(抗原)的竞争作用。,常用的纯化方法有葡聚糖凝胶层析法和饱和硫酸铵沉淀法等。,2.酶标记物的鉴定,（1）活性鉴定：免疫活性常用免疫电泳或双向免疫扩散法，出现沉淀线表示结合物中的抗体(抗原)具有免疫活性。酶活性用DAB显示反应,（2）酶标记率测定：用分光光度法分别测定结合物中酶和抗体(抗原)蛋白的含量，然后按公式计算其标记率。,酶联：制备酶标记的抗原或抗体免疫吸附：将抗原或抗体预先结合到固相载体表面技术特点：1.酶反应的高敏感性。2.只需经过固相的洗涤，就可以达到抗原抗体复合物与其他物质的分离，大大简化了操作步骤。 酶联免疫吸附法是一种非均相免疫测定技术。成为目前临床检验中应用较广的免疫测定方法。,一、基本原理,一、基本原理,二、方法类型和检测原理,方法类型,在这些测定方法中有3种必要的试剂：,固相的抗原或抗体,酶标记的抗原或抗体,酶作用的底物,（一）双抗体夹心法检测抗原,将己知抗体包被固相载体，待检标本中的相应抗原与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合成分。然后再与抗原特异的酶标抗体结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，根据加底物后的显色确定是否含有相应抗原或依据显色程度确定待检抗原的含量。,1.原理,1.将抗体包被在固相载体上。,2.如样品中含有抗原，则结合为抗原抗体复合物。,3.再加入酶标记抗体，则结合为抗体-抗原-酶标记抗体复合物。,+,4.酶催化底物并显色。,双抗体夹心法,-,ELISA结果：,阳性,阴性,空白,双位点一步法,即在双抗体夹心法基础上使用针对抗原分子上两个不同表位的单克隆抗体，分别作为固相抗体和酶标抗体。测定时将待检标本和酶标抗体同时加入进行反应，两种抗体互不干扰，经一次温育和洗涤后，即可加入底物进行显色测定。,1原理,如果待检标本中抗原浓度过高， 容易形成“钩状效应（hook effect）”。钩状效应严重时，可出现假阴性结果，必要时可将待检标本适当稀释后重新测定。,2注意事项,（二）间接法检测抗体,将已知抗原吸附于固相载体上，待检标本中相应抗体与之结合，形成固相抗原-抗体复合物，再用酶标二抗与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-抗体-酶标二抗复合物，根据加底物后的显色程度确定待检抗体含量。,1原理,间接法测抗体,（三）竞争法,酶标抗原和待检抗原对固相特异性抗体具有相同的结合力，二者竞争结合固相特异性抗体。免疫反应后，结合于固相的酶标抗原量与标本中待检抗原含量呈反比。待检抗原量越多，酶标抗原与固相抗体结合越少，底物显色反应越浅；反之则显色越深，即底物显色与待检标本中抗原含量呈反比。,1原理,竞争法测抗原,（四）捕获法检测抗体,将抗人IgM抗体吸附于固相载体上，待检标本中的IgM类抗体多被固相抗体捕获。加入特异抗原与固相抗体捕获的IgM类抗体结合，再加入抗原特异的酶标抗体，形成固相抗人IgM-IgM-抗原-酶标抗体复合物。最后根据加底物后的显色程度确定待检IgM抗体的含量。,1原理,采用固相捕获法检测IgM类抗体时要注意的是RF（IgM类）及其它非特异IgM的干扰。RF（IgM类）能与固相抗人IgM抗体结合，并可与随后加入的酶标抗体（动物IgG）反应，从而导致假阳性反应。,3注意事项,三、技术要点,（一）包被技术,将抗原或抗体结合于固相载体的过程。,包被coating,1.固相吸附好，不易脱落2.原有免疫活性稳定这是酶联免疫吸附试验的基础,1. 固相载体的要求,结合抗体(抗原)的容量大，结合稳定；固相材料具有良好可塑性、透明性高固相化后分子仍应保持活性；固相化方法应简便、快速；材料成本低。,固相载体的种类,1塑料制品 由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。形状 主要有微量反应板、小试管和小珠三种。,2微颗粒 微颗粒是由高分子单体聚合成的微球 或颗粒。,3.微孔虑膜 是一种多孔薄膜过滤材料，包括硝酸 纤维素膜（NC）、尼龙膜和玻璃纤维素膜等。,直接法： 将抗体或抗原分子直接被动吸附固相材料表面。 常用包被缓冲液 pH9.6碳酸盐溶液,pH7.4磷酸盐溶液。 抗原或抗体浓度影响包被效率间接法： 亲和素-生物素化抗体或抗原模式 SPA-抗体模式,2. 包被方法,Question: 传统的包被使抗原或者抗体吸附固相上的过程是低效及随机的。,Answer: 通过技术革新，人为控制抗原或者抗体吸附固相上的过程，提高检测敏感性和准确性。,oriented antibody,The higher direct binding efficiency of inovational ELISA plates can result in assays with greater sensitivity and increased signal dynamic range compared to conventional plates,用1%5%的牛血清白蛋白或5%20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附的过程,封闭blocking,3. 封闭,抗体匹配分析：1.剂量曲线是否符合要求2.非特异性结合较弱，本底低3.标准品与质控品相吻合性4.抗体的用量,（二）抗体匹配,（三）确定最佳工作浓度,抗体最佳浓度分析：1.剂量曲线是否符合要求2.非特异性结合较弱，本底低3.最大OD值是否在2.0左右4.抗体的用量,第四节 酶免疫印迹试验,免疫印迹试验,原理,1.分离蛋白质：抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动。,2.转印蛋白质：将在凝胶中已经分离的蛋白质条带转移至NC膜上，选用低电压(100v)和高电流(12A)，通电45min转移即可完成。,3.免疫反应及显色：印有蛋白条带的NC膜依次与特异性抗体和酶标二抗作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。阳性反应的条带染色清晰，根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。,免疫印迹试验,生物素-亲和素系统在酶免疫技术中应用,维生素H/辅酶R动、植物组织中广泛分布, 卵黄和肝含量高,现可人工合成MW 244.31kD结构：咪唑酮环噻吩环（图）,(一)生物素(Biotin, B),生物素化标记物（Ag、Ab、酶等）,经化学修饰,带不同化学活性基团,活化生物素,标记蛋白质,avidin（AV) 和 streptavidin ( SA)：能特异性结合生物素,一个亲和素有四个生物素结合位点均为大分子蛋白几乎可同所有标记物结合,(一)亲和素(Avidin，A),结构 四亚基糖蛋白 四肽链蛋白 无糖基PI 10.5 6结合位 色氨酸 色氨酸可结合B 4个 4个Ka 1015 1015活性 1315 1518,亲合素（A）,链霉亲合素(SA),一、多级放大、灵敏度高二、亲和力高、特异性强三、稳定性强、不可逆结合四、适用性广、易偶联五、简易、快速,生物素-亲合素系统的特点,生物素-亲和素技术在ELISA中的应用类型,A为标记亲和素 B为标记生物素,基本原理：直接BA-ELISA是以酶标亲合素直接连接生物素化抗体。间接BA-ELISA采用生物素化的二抗，可进一步提高检测灵敏度。BA-ELISA中亲和素与酶的共价结合对酶的活性有一定程度的损伤。,1.BA-ELISA,BA-ELISA检测抗原,直接法,BA-ELISA检测抗体,间接法,基本原理：直接BAB-ELISA是以游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素的多价性，将生物素化抗体和酶标生物素连接起来，以检测反应分子。间接BAB-ELISA是在加入抗体后，再用生物素化的二抗，使反应增加一个层次，从而使灵敏度进一步提高。,2BAB-ELISA,BAB-ELISA,间接法,基本原理：亲合素与酶标生物素结合形成亲合素-生物素-酶复合物(ABC)。当其与生物素化抗体(直接ABC-ELISA)或生物素化二抗(间接ABC-ELISA)相遇时，ABC中未饱和的亲合素结合部位可与抗体上的生物素结合，使抗原抗体反应体系与ABC体系连成一体。通过依次的相互连接作用，形成一个具有多级放大作用的晶格样网状结构，使检测敏感性明显提高。,3ABC-ELISA,ABC-ELISA,酶免疫技术的应用,1.病原体及其抗体广泛应用于传染病的诊断。2.蛋白质：各种免疫球蛋白、补体组分、肿瘤标志物3.非肽类激素:如T3、T4、雌激素、皮质醇等。4.药物和毒品: 如地高辛、苯巴比妥、庆大霉素、吗啡等,酶免疫技术是标记免疫技术的一种，它是以酶标记的抗原或抗体作为主要试剂的免疫检测方法，在抗原与抗体的特异性反应完成后，通过酶对底物的作用进一步提高敏感性。 酶免疫技术可分为酶免疫组织化学技术和酶免疫测定两大类,后者根据抗原抗体反应后是否需要分离结合与游离的酶标记物而分为均相和非均相两种类型。 非均相酶免疫测定根据是否