免疫组化(SP法)原理步骤及试剂

1 免疫免疫组组化原理步化原理步骤骤及及试剂试剂 原理原理 抗原抗体反应 即抗原与抗体特异性结合的原理 通过化学反应使标记抗体的显色剂 荧光素 酶 金属离子 同位素 显色来确 定组织细胞内抗原 多肽和蛋白质 对其进行定位 定性及定量的研究 众所周知 抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性 免疫组化正是利用这一特性 即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出 来 以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物 制备特异性抗体 再用这种抗体 第一抗体 作为抗原去免疫动物制备第二抗体 并用某种 酶 常用辣根过氧化物酶 或生物素等处理后再与前述抗原成分结合 形成抗原 一抗 二抗复合物 将抗原放大 由于抗体与抗原结 合后形成的免疫复合物是无色的 因此 还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来 常用显色剂 DAB 显示为棕黄色颗 粒 通过抗原抗体反应及呈色反应 显示细胞或组织中的化学成分 在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物 从而能 够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布 含量 组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质 如蛋白质 多肽 氨基酸 多糖 磷 脂 受体 酶 激素 核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测 分分类类 常用 1 免疫 免疫荧荧光方法光方法 最早建立的免疫组织化学技术 它利用抗原抗体特异性结合的原理 先将已知抗体标上荧光素 以此作为探针检查细胞或组织内的 相应抗原 在荧光显微镜下观察 当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光 从而可确定组织中某种抗 原的定位 进而还可进行定量分析 由于免疫荧光技术特异性强 灵敏度高 快速简便 所以在临床病理诊断 检验中应用比较广 2 免疫免疫酶标酶标方法方法 免疫酶标方法是继免疫荧光后 于 60 年代发展起来的技术 基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用 然后加入酶的底物 生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒 通过光镜或电镜 对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究 免疫酶标技 术是目前定位准确 对比度好 染色标本可长期保存 适合于光 电镜研究等 免疫酶标方法的发展非常迅速 已经衍生出了多种标记方 法 目前在病理诊断中广为使用的当属 PAP 法 过氧化物酶 抗过氧化物酶 ABC 法 卵白素 生物素 过氧化物酶复合物 SP 法 法 链链霉霉 菌抗生物素蛋白菌抗生物素蛋白 过过氧化物氧化物酶酶 即用型二步法 聚合物链接 等 3 免疫胶体金技 免疫胶体金技术术 免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物 胶体金是指金的水溶胶 它能迅速而稳定地吸附蛋白 对蛋白的 生物学活性则没有明显的影响 因此 用胶体金标记一抗 二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子 如葡萄球菌 A 蛋白 等作为探针 就能对组织或细胞内的抗原进行定性 定位 甚至定量研究 由于胶体金有不同大小的颗粒 且胶体金的电子密度高 所以免疫胶体金 技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究 由于胶体金本身呈淡至深红色 因此也适合进行光镜观察 如应用银加强的免疫 金银法则更便于光镜观察 4 免疫 免疫铁铁蛋白法蛋白法 5 放射免疫自 放射免疫自显显影法影法 标标本本 1 组织标本 石蜡切片石蜡切片 病理切片和组织芯片 冰冻切片 2 细胞标本 组织印片 细胞爬片 细胞涂片 操作步操作步骤骤 2 石蜡切片制作石蜡切片制作 1 固定 取组织 用 PBS 冲洗 放入 4 多聚甲醛磷酸盐缓冲液内固定 12h 2 脱水 倒去固定液 用蒸馏水冲洗 3 次 再用 50 酒精冲洗 2 次 用酒精逐级脱水 70 酒精 1 天 80 酒精过夜 95 酒精 3h 无 水酒精 各 2h 3 透明 1 1 无水酒精二甲苯 45min 二甲苯 各 30min 4 包埋 恒温箱内进行 浸入石蜡 1 1 二甲苯石蜡 58 45min 石蜡 共 2 5h 用石蜡 包埋组织 5 切片 包埋后的组织块经修整后 用切片机切成 5 7 m 的石蜡带 6 贴片 将组织石蜡块在 50 温水中展片 然后用处理干净的载玻片捞片 组织带可黏在载玻片上 洗片 1 HCl 浸泡过夜 蒸馏水冲洗 95 酒精浸泡 2h 后擦干 涂胶 防脱剂多聚赖氨酸 7 烤片 68 恒温箱内烤片 2h SP 三步法三步法 1 脱蜡 脱蜡前应将组织芯片在室温中放置 60min 或 60 恒温箱中烘烤 20min 后用二甲苯 浸泡 共 25min 2 水化 无水酒精 各 2min 下行至 95 80 70 酒精 各 2min 3 PBS 冲洗 2 3 次 每次 5min 4 阻断 3 H2O2去离子水 或 80 甲醇 孵育 10min 以灭活内源性过氧化物酶活性 5 PBS 冲洗 2 3 次 每次 5min 6 抗原修复 置 0 01M 枸橼酸缓冲液 PH 6 0 中用煮沸 95 15 20min 自然冷却 20min 以上 再用冷水冲洗缸子 加快冷却至室 温 7 PBS 冲洗 2 3 次 每次 5min 8 封闭 滴加正常山羊血清封闭液 室温孵育 20min 甩去多余液体 9 滴加 抗 50 l 室温静置 1h 或者 37 1h 或者 4 过夜 需在 37 复温 45min 10 PBS 冲洗 2 3 次 每次 5min 11 滴加辣根过氧化物酶标记的 抗 40 50 l 室温静置 1h 或 37 1h 12 PBS 冲洗 2 3 次 每次 5min 13 滴加 SP 链霉亲和素 过氧化物酶 室温或 37 孵育 30min 1h 14 PBS 冲洗 2 3 次 每次 5min 15 显色 DAB 显色 5 10min 在显微镜下掌握染色程度 胞浆呈棕色者判定为阳性细胞 显色剂的配置 在 1ml 水中加 1 滴显色剂 A 摇匀 然后加 1 滴显色剂 B 摇匀 再加 1 滴显色剂 C 摇匀 A DAB B H2O2 C 磷酸缓冲液 16 自来水冲洗 10 分钟终止反应 17 复染 苏木精复染 2min 盐酸酒精分化 18 自来水冲洗 10 15min 19 常规脱水 透明 封片 用中性树胶滴在组织旁边 再用盖玻片盖上 镜检 结结果分析 果分析 每张切片选择 5 个高倍镜视野 400X 应用图像分析系统进行定量灰度扫描后进行分析 试剂试剂 设备设备 3 1 PBS 0 01M 磷酸磷酸盐缓盐缓冲液冲液 pH7 4 配制 取 NaCl 8g KCl 0 2g Na2HPO4 12H2O 3 63g 或 Na2HPO4 1 44g KH2PO4 0 24g 溶于 900ml 双蒸水中 用盐酸调 pH 值至 7 4 加水定容至 1L 常温保存备用 2 固定液 固定液 4 多聚甲多聚甲醛醛磷酸磷酸盐缓盐缓冲液冲液 pH7 4 配制 a 0 1M 磷酸盐缓冲液 取 A 液 400ml 与 B 液 80ml 混合后 调 pH 于 7 4 再定容至 500ml A 液 0 1mol L Na2HPO4 Na2HPO4 12H2O 35 8g 加水定容至 1000ml B 液 0 1mol L NaH2PO4 NaH2PO4 2H2O 15 6g 加水定容至 1000ml b 4 多聚甲醛磷酸盐缓冲液 取 20g 多聚甲醛溶于 500ml 0 1M 磷酸盐缓冲液中 加热并搅拌约 2 3h 后溶解 3 梯度酒精 梯度酒精 100 95 80 70 50 4 二甲苯 二甲苯 5 包埋 包埋剂剂 石蜡 石蜡 6 防脱 防脱剂剂 多聚 多聚赖赖氨酸 氨酸 PLL5g 蒸蒸馏馏水水 1000ml APES 3 氨丙基 3 乙氧基甲硅烷 7 抗原修复液 抗原修复液 0 01M 枸枸橼橼酸酸缓缓冲液 冲液 PH 6 0 或 0 01M 柠柠檬酸檬酸盐缓盐缓冲液 冲液 pH6 0 配制 取 A 液 8ml 与 B 液 42ml 混合后加水至 400ml 调 pH 于 6 0 再定容至 500ml A 液 0 1mol L 柠檬酸 C6H8O7 H2O 21 01g 加水定容至 1000ml B 液 0 1mol L 柠檬酸钠 Na3C6H5O7 2H2O 29 41g 加水定容至 1000ml 8 SP 超敏免疫超敏免疫组组化化试剂试剂盒盒 包括试剂 A B C D 试剂 A 阻断阻断剂剂 3 甲醇甲醇 H2O2溶液溶液 30 H2O2和 80 甲醇溶液配制 试剂 B 封封闭闭液 正常非免疫液 正常非免疫动动物血清物血清 试剂 C 二抗 辣根二抗 辣根过过氧化物氧化物酶标记酶标记 试剂 D SP 链链霉霉亲亲和素和素 过过氧化物氧化物酶酶 9 一抗 特异 一抗 特异结结合底物 合底物 10 显显色色剂剂 DAB 试剂试剂盒 盒 苏苏木素染液木素染液 11 封固液 中性 封固液 中性树树胶胶 或 50 缓冲甘油 或液体石蜡等 12 恒温箱 水浴锅 冰箱 切片机 载玻片和盖玻片 高压锅或微波炉 染色缸 显微镜 计算机图像分析系统 附 EDTA 乙二胺四乙酸 即依地酸钠钙 是钙离子络合剂 洗涤剂 血液抗凝剂 常用固定液常用固定液 1 醛类醛类固定固定剂剂 作用是使组织之间相互交联 将抗原保存在原位 4 1 3 中性甲醛固定液液 30 甲醛 10ml 0 01mol L PH 7 4 PBS 90ml 2 24 多聚甲多聚甲醛缓醛缓冲液冲液 40g 多聚甲醛溶于 0 1mol L PBS 500ml 加热 搅拌 注意不要沸腾 至溶液清亮后 室温下冷却后加 PBS 使总容量为 1000ml 3 戊二醛 多聚甲醛缓冲液 在上述溶液中加入 1 的戊二醛 4 Bouin 液 40 甲醛 250ml 冰醋酸 50ml 饱和苦味酸 750ml 5 PLP 液 过碘酸 赖氨酸 多聚甲醛固定液 2 丙 丙酮酮及醇及醇类类固定固定剂剂 原理是使组织中的蛋白质和糖类沉淀 1 AAA 液 纯酒精 85ml 冰醋酸 5ml 浓甲醛 10ml 2 Clzrke 液 纯酒精 95ml 冰醋酸 5ml 多用于冰冻切片的后固定 3 Carnoy 液 纯酒精 60ml 氯仿 30ml 冰醋酸 10ml 多用于癌基因蛋白 抗癌基因蛋白等抗原的固定保存 4 丙酮 常用于冰冻切片和细胞涂片的后固定 用前在 4 冰箱预冷 切片在冷丙酮中固定 5 10min 3 其他固定 其他固定剂剂 1 Zenker 液 适合免疫球蛋白抗原的检测 2 四氯化锇液 是电镜研究中所必需的固定液 抗原修复抗原修复 用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片 原因 a 福尔马林固定时 组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成了醛键 使得 不少抗原决定簇被封闭 b 甲醛的聚合作用 使蛋白质分子间相互交联形成大分子网络 也导致了抗原决定簇被掩盖 这就使得相当部 分的抗原不能与抗体很好是进行反应 抗原抗原热热修复修复 1 高压热修复 在沸水中加入 0 5mol L EDTA 缓冲液 pH8 0 或 0 01M 枸橼酸钠缓冲溶液 pH6 0 盖上不锈钢高压锅的盖子 但不 进行锁定 将玻片置于金属染色架上 缓慢加压 使玻片在缓冲液中浸泡 5 分钟 然后将盖子锁定 小阀门将会升起来 10 分钟后 去除 热源 置入凉水中 当小阀门沉下去后打开盖子 本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复 2 煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热 0 01M 枸橼酸钠缓冲溶液 pH6 0 至 95 左右 放入组织芯片加热 10 15 分钟 3 微波热修复 在微波炉里加热 0 01M 枸橼酸钠缓冲溶液 pH6 0 至沸腾后将组织芯片放入 断电 间隔 5 10 分钟 反复 1 2 次 适用 的抗原有 AR Bax Bcl 2 C fos X jun C kit C myc E cadherin Chromogranin A Cyclin ER Heat shock pr