引物设计原则(必看)

mi 引物设计原则 1 引物的长度一般为 15 30 bp 常用的是 18 27 bp 但不应大于 38 因为过长 会导致其延伸温度大于 74 不适于 Taq DNA 聚合酶进行反应 2 引物序列在模板内应当没有相似性较高 尤其是 3 端相似性较高的序列 否 则容易导致错配 引物 3 端出现 3 个以上的连续碱基 如 GGG 或 CCC 也会 使错误引发机率增加 3 引物 3 端的末位碱基对 Taq 酶的 DNA 合成效率有较大的影响 不同的末位 碱基在错配位置导致不同的扩增效率 末位碱基为 A 的错配效率明显高于其他 3 个碱基 因此应当避免在引物的 3 端使用碱基 A 另外 引物二聚体或发夹 结构也可能导致 PCR 反应失败 5 端序列对 PCR 影响不太大 因此常用来引 进修饰位点或标记物 4 引物序列的 GC 含量一般为 40 60 过高或过低都不利于引发反应 上下游 引物的 GC 含量不能相差太大 5 引物所对应模板位置序列的 Tm 值在 72 左右可使复性条件最佳 Tm 值的 计算有多种方法 如按公式 Tm 4 G C 2 A T 在 Oligo 软件中使用的是最 邻近法 the nearest neighbor method 6 G 值是指 DNA 双链形成所需的自由能 该值反映了双链结构内部碱基对的 相对稳定性 应当选用 3 端 G 值较低 绝对值不超过 9 而 5 端和中间 G 值相对较高的引物 引物的 3 端的 G 值过高 容易在错配位点形成双链结构 并引发 DNA 聚合反应 7 引物二聚体及发夹结构的能值过高 超过 4 5kcal mol 易导致产生引物二聚 体带 并且降低引物有效浓度而使 PCR 反应不能正常进行 8 对引物的修饰一般是在 5 端增加酶切位点 应根据下一步实验中要插入 PCR 产物的载体的相应序列而确定 引物序列应该都是写成 5 3 方向的 Tm 之间的差异最好控制在 1 度之内 另外我觉得扩增长度大一些比较好 500bp 左右 要设计引物首先要找到 DNA 序列的保守区 同时应预测将要扩增的片段单链 是否形成二级结构 如这个区域单链能形成二级结构 就要避开它 如这一段 不能形成二级结构 那就可以在这一区域设计引物 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性 产物不能形成二级结构 引物长度一般在 15 30 碱基之间 G C 含量在 40 60 之间 碱 基要随机分布 引物自身不能有连续 4 个碱基的互补 引物之间不能 有连续 4 个碱基的互补 引物 5 端可以修饰 引物 3 端不可修饰 引物 3 端要避开密码子的第 3 位 1 引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过 70 或有连续 8 个互 补碱基同源 2 避开产物的二级结构区 某些引物无效的主要原因是引物重复区 DNA 二级结 构的影响 选择扩增片段时最好避开二级结构区域 用有关计算机软件可以预 测估计 mRNA 的稳定二级结构 有助于选择模板 实验表明 待扩区域自由能 G 小于 58 6lkJ mol 时 扩增往往不能成功 若不能避开这一区域时 用 7 deaza 2 脱氧 GTP 取代 dGTP 对扩增的成功是有帮助的 3 长度 寡核苷酸引物长度为 15 30bp 一般为 20 27mer 引物的有效长度 Ln 2 G C A T Ln 值不能大于 38 因为 38 时 最适延伸温度会超 过 Taq DNA 聚合酶的最适温度 74 不能保证产物的特异性 4 G C 含量 G C 含量一般为 40 60 其 Tm 值是寡核苷酸的解链温度 即 在一定盐浓度条件下 50 寡核苷酸双链解链的温度 有效启动温度 一般高 于 Tm 值 5 10 若按公式 Tm 4 G C 2 A T 估计引物的 Tm 值 则 有效引物的 Tm 为 55 80 其 Tm 值最好接近 72 以使复性条件最佳 5 碱基础随机分布 引物中四种碱基的分布最好是随机的 不要有聚嘌呤或聚嘧 啶的存在 尤其 3 端不应超过 3 个连续的 G 或 C 因这样会使引物在 G C 富集 序列区错误引发 6 引物自身 引物自身不应存在互补序列 否则引物自身会折叠成发夹状结构牙 引物本身复性 这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合 若 用人工判断 引物自身连续互补碱基不能大于 3bp 7 引物之间 两引物之间不应不互补性 尤应避免 3 端的互补重叠以防引物二聚 体的形成 一对引物间不应多于 4 个连续碱基的同源性或互补性 8 引物的 3 端 引物的延伸是从 3 端开始的 不能进行任何修饰 3 端也不能有 形成任何二级结构可能 除在特殊的 PCR AS PCR 反应中 引物 3 端不能 发生错配 在标准 PCR 反应体系中 用 2U Taq DNA 聚合酶和 800 mol L dNTP 四种 dNTP 各 200 mol L 以质粒 103 拷贝 为模板 按 95 25s 55 25s 72 1min 的循环参数扩增 HIV 1 gag 基因区的条件下 引 物 3 端错配对扩增产物的影响是有一定规律的 A A 错配使产量下降至 1 20 A G 和 C C 错七下降至 1 100 引物 A 模板 G 与引物 G 模板 A 错 配对 PCR 影响是等同的 9 引物的 5 端 引物的 5 端限定着 PCR 产物的长度 它对扩增特异性影响不大 因此 可以被修饰而不影响扩增的特异性 引物 5 端修饰包括 加酶切位点 标记生物素 荧光 地高辛 Eu3 等 引入蛋白质 结合 DNA 序列 引入突变位点 插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等 10 密码子的简并 如扩增编码区域 引物 3 端不要终止于密码子的第 3 位 因 密码子的第 3 位易发生简并 会影响扩增特异性与效率 Hairpin 发卡结构 如果自由能值大于 0 则该结构不稳定从而不会干扰反应如果自由能值小于 0 则 该结构可以干扰反应 二聚体可以在序列相同的两条引物或正反向 引物之间形成如果配对区域在 3 末端问题会更为严重 3 末端配对很容易引起引物二聚 体扩增使 Pair Rating 匹配度评分匹配度低的引物对常常不太有效是因为在同样退火温度 下 Tm 低的引物决定扩增的特异性而 Tm 高的引物更易于形成非特异性结合而 造成错误的起始 1 引物的长度以 15 30bp 为宜 否则会影响扩增的特异性 2 碱基尽可能随机分布 避免相同的碱基成串排列 引物的 G C 含量在 40 60 之间 若 G C 含量太低 可在 5 端加上一些 G 或 C 若 G C 含量 太高 可在 5 端加上一些 A 或 T 3 应避免每条引物内部形成二级结构及两条引物的 3 端互补形成引物二聚 体 避免在引物的 3 端有 3 个 G 或 3 个 C 成串排列 3 端的末位碱基最好选 T C G 而不选 A 也有建议在引物的两端用 1 2 个嘌呤碱基 4 尽可能使用两条引物的 Tm 值相同 最好相差不要超过 5 退火温 度根据较低的 Tm 值选定 也可以通过改变引物的长度来平衡两条引物的退火 温度 Tm 值可以根据 Tm 4 G C 2 A T 计算 而对于较长的引物 Tm 值需 要考虑动力学参数 从 最近邻位 的计算方式得到 现有的 PCR 引物设计软件 大多数都采用这种方式 注 对于 Tm 值的计算有争议的地方是附加序列应 不应该计算在内 我觉得有值得商讨的地方 因为从理论上只有最开始的循环 引物的附加序列是不与模板链结合的 而在后来的 PCR 反应中 引物的附加序 列是和模板链结合了的 5 引物的 3 端要与模板严格配对 而 5 端碱基没有严格的限制 只要与模 板 DNA 结合的部分足够长 其 5 端碱基可不与模板 DNA 配对而呈游离状态 这样 我们可以在引物的 5 末端加上酶切位点 引入酶切位点时 要考虑到进 行双酶切的共用缓冲液 否则给下游工作带来困难 启动子 方便下游操作 6 不要在扩增序列的二级结构区设计引物 以免退火困难 也要考虑引物 设计处模板的特异性 PCR 引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段 使其能有效地扩增模 板 DNA 序列 因此 引物的优劣直接关系到 PCR 的特异性与成功与否 要设计引物首先要找到 DNA 序列的保守区 同时应预测将要扩增的片段单链 是否形成二级结构 如这个区域单链能形成二级结构 就要避开它 如这一段 不能形成二级结构 那就可以在这一区域设计引物 现在可以在这一保守区域里设计一对引物 一般引物长度为 15 30 碱基 扩增 片段长度为 100 600 碱基对 让我们先看看 P1 引物 一般引物序列中 G C 含量一般为 40 60 而且四种 碱基的分布最好随机 不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在 否则 P1 引物设计的就不合 理 应重新寻找区域设计引物 同时引物之间也不能有互补性 一般一对引物间不应多于 4 个连续碱基的互补 引物确定以后 可以对引物进行必要的修饰 例如可以在引物的 5 端加酶切位 点序列 标记生物素 荧光素 地高辛等 这对扩增的特异性影响不大 但 3 端绝对不能进行任何修饰 因为引物的延伸是从 3 端开始的 这里还需提醒的 是 3 端不要终止于密码子的第 3 位 因为密码子第 3 位易发生简并 会影响扩 增的特异性与效率 综上所述我们可以归纳十条 PCR 引物的设计原则 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性 产物不能形成二级结构 引物长度一般在 15 30 碱基之间 G C 含量在 40 60 之间 碱基要随机分布 引物自身不能有连续 4 个碱基的互补 引物之间不能有连续 4 个碱基的互补 引物 5 端可以修饰 引物 3 端不可修饰 引物 3 端要避开密码子的第 3 位 PCR 引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段 使其能有效地扩增模板 DNA 序列 如前述 引物的优劣直接关系到 PCR 的特异性与成功与否 对引 物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保 PCR 的成功 但遵循某些原则 则 有助于引物的设计 1 引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过 70 或有连续 8 个互补碱基同源 2 避开产物的二级结构区 某些引物无效的主要原因是引物重复区 DNA 二级结构的影响 选择扩增片段 时最好避开二级结构区域 用有关计算机软件可以预测估计 mRNA 的稳定二级 结构 有助于选择模板 实验表明 待扩区域自由能 G 小于 58 6lkJ mol 时 扩增往往不能成功 若不能避开这一区域时 用 7 deaza 2 脱氧 GTP 取代 dGTP 对扩增的成功是有帮助的 3 长度 寡核苷酸引物长度为 15 30bp 一般为 20 27mer 引物的有效长度 Ln 2 G C A T Ln 值不能大于 38 因为 38 时 最适延伸温度会超过 Taq DNA 聚合酶的最适温度 74 不能保证产物的特异性 4 G C 含量 G C 含量一般为 40 60 其 Tm 值是寡核苷酸的解链温度 即在一定盐浓度 条件下 50 寡核苷酸双链解链的温度 有效启动温度 一般高于 Tm 值 5 10 若按公式 Tm 4 G C 2 A T 估计引物的 Tm 值 则有效引物的 Tm 为 55 80 其 Tm 值最好接近 72 以使复性条件最佳 5 碱基础随机分布 引物中四种碱基的分布最好是随机的 不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在 尤其 3 端不应超过 3 个连续的 G 或 C 因这样会使引物在 G C 富集序列区错误引发 6 引物自身 引物自身不应存在互补序列 否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复 性 这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合 若用人工判断 引物自身连续互补碱基不能大于 3bp 7 引物之间 两引物之间不应不互补性 尤应避免 3 端的互补重叠以防引物二聚体的形成 一对引物间不应多于 4 个连续碱基的同源性或互补性 8 引物的 3 端 引物的延伸是从 3 端开始的 不能进行任何修饰 3 端也不能有形成任何二级 结构可能 除在特殊的 PCR AS PCR 反应中 引物 3 端不能发生错配 在标准 PCR 反应体系中 用 2U Taq DNA 聚合酶和 800 mol L dNTP 四种 dNTP 各 200 mol L 以质粒 103 拷贝 为模板 按 95 25s 55 25s 72 1min 的循环参数扩增 HIV 1 gag 基因区的条件下 引物 3 端错配对 扩增产物的影响是有一定规律的 A A 错配使产量下降至 1 20 A G 和 C C 错七下降至 1 100 引物 A 模板 G 与引物 G 模板 A 错配对 PCR 影响 是等同