刘殿武肝病蛋白质组学培训

肝病蛋白质组学研究,刘殿武 河北医科大学公卫学院 2014.6,蛋白质组学是干什么的？蛋白质组学研究解决什么问题？,黑猩猩与人染色体差异 1.23%(Science, 2002),差异否？,蛋白质组学是干什么的？,研究不同物种间差异研究同种具有不同特征物种间差异研究物种进化不同阶段的差异 物种间蛋白质差异,Introduction,Application,Research example,1,2,3,Introduction,随着基因组研究的进一步深入，人们越来越清晰地知道了人类的全部遗传密码即基因组序列，这是否意味着人类可以任意控制人的生老病死呢？,人类基因组计 划(human genome project, HGP)是由美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式 启动的。美国、英国、 法兰西共和国、德国、日本和我国科学家共同参与了这一预算达30亿美元的 人类基因组计划。 2001年得到人类基因组序列的草稿，2003年得到最后定稿,人类基因组计划,什么是蛋白质？,蛋白质是一种复杂的有机生物大分子，它们是生命活动的实际执行者。 蛋白质由一个一个的氨基酸首尾相接形成肽链，肽链再折叠形成一定空间结构。,什么是蛋白质？,？,什么是蛋白质组？,蛋白质组 “proteome”一词源于“PROTEin”与“genOME”的杂合。是指“由一个基因组、一种生物或一个细胞/组织的基因组所表达的全套蛋白质”。,荧光染色的细胞内蛋白质,蛋白组学的研究方法,分离技术,鉴定技术,功能研究,Introduction,样品制备技术,一、样品制备技术,蛋白样品制备的一般要求1.应使所有待分析蛋白样品全部处于溶解状态，且制备方法应具有重现性。2.保证样品在电泳过程中保持溶解状态，避免溶解性低的蛋白质在等点聚焦时由于溶解度降低而沉淀析出。3.排除多糖、核酸、脂类其他干扰分子；同时避免处理环境对蛋白质的污染。,4.防止样品处理过程中发生蛋白质的化学修饰，包括蛋白质降解、蛋白酶或尿素热分解后引起的修饰；5.尽量去除起干扰作用的高峰度或无关蛋白，保证待研究蛋白在可检测水平6.尽可能缩短样品的处理时间，尽可能在低温环境中处理。,常用的处理方法,1. 细胞的洗涤2. 细胞的破碎裂解3. 除去污染物4. 微透析5. 电泳脱盐6. 蛋白沉淀,1.细胞的洗涤 目的：去除污染物 常用的缓冲液：PBS 注意：保持适当的渗透压，避免细胞 溶解。,2.细胞的破碎裂解 不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的破碎方法。,各种细胞破碎方法的应用范围,3.除去污染物 DNA/RNA 脂类污染物的种类 盐 固体杂质,4. 微透析 常用于小体积样品 膜的截留分子量8000Da,5.蛋白沉淀 目的：低浓度蛋白可以得到浓缩； 有时可以去除某些干扰物质； 抑制蛋白酶活性； 方法：硫酸铵沉淀法； 三氯乙酸沉淀法； 丙酮沉淀法； 丙酮/三氯乙酸沉淀法；,二、 分离技术：,1. Two-dimensional Protein Electrophoresis (2DE),分离技术,2. 荧光差异显示双向电泳（Fluorescence 2D differential gel electrophoresis，F-2D DIGE） 这是一种定量分析凝胶上蛋白质点的新方法. 它是将待比较的两种样品提取的总蛋白质分别与两种不同的荧光标记试剂（Cy2、Cy3或Cy5）进行共价标记，然后将不同荧光染料标记的两种待比较的蛋白质样品等量混合，上样进行双向电泳，2D凝胶在成像仪上用两种不同波长激发，并将两种样品的荧光图谱显示成像，用2D分析软件进行定量分析。将定量上显示有明显差异的蛋白质点切下后进行鉴定分析，从而确定差异表达的蛋白质。,三、鉴定技术,1. 质谱技术,2. 同位素亲和标签（isotope-coded affinity tags, ICAT）,一种定量研究蛋白质表达谱的新方法。 ICAT是一种人工合成的化学试剂。ICAT反应基团与蛋白质的Cys残基共价结合，充分反应后，将两种标记后的蛋白等量混合，再用胰蛋白酶解。经抗生物素的亲和层析纯化后，含生物素的ICAT酶解片段可以进行在线HPLC-MS/MS 分析。,Introduction,Application,Research example,1,2,3,应用价值,1. 癌症目前用到的肿瘤标志物，从19世纪鉴定的骨髓瘤的本周氏蛋白到上皮癌细胞系肿瘤特异性抗体都是基于蛋白组学的方法得到的。对于与癌有关的蛋白来说，用多种抗体可以使我们了解该通路中的蛋白特征，例如，一些癌基因产物或细胞周期蛋白的过表达或者是翻译后修饰可以在转化的肝细胞中检测到.,2.感染性疾病近年来，除结核、多重耐药链球菌感染及机会致病菌外，出现了一些新的感染因素如HIV、埃博拉病毒等。因此这些致病微生物的蛋白质组分析，对于了解其毒性因子、抗原及疫苗的制备非常重要，此外对疾病的诊断、治疗和预防也同样重要。,3.其他疾病 如扩张型心脏疾病，目前其发病机理不明，推测可能为多种因素所致。Knecht等采用2-DE取得了3300个心肌蛋白条带，通过氨基酸序列分析、Edman降解法及基质辅助的激光解吸离子化质谱（MALDI-MS）等分析了其中150条。经活检及术后病理证实，有12条为扩张性心肌病特有的蛋白。但具体资料尚在进一步分析之中。,Application in Diagnosis,应用SELDI-TOF-MS 技术对乳头吸液（nipple aspirate fluid, NAF）标本进行蛋白质组学分析，结果显示，在乳腺癌和正常乳腺的NAF 中有5 种差异表达蛋白质， 其中6.5 kD 和15.9 kD 的蛋白质敏感性和特异性最好， 在乳腺癌患者中阳性率为25%-84%，而在正常人中阳性率为0-9%。将NAF 的蛋白质组学分析与乳腺X线摄影和物理检查结合可提高乳腺癌的早期诊断率。,Application in Diagnosis,SELDI-TOF-MS分析82例肝硬化患者(其中38例不伴有HCC, 44例为HCC)血清,鉴定了一种分子量为8 900D的蛋白在HCC组织表达上调,此蛋白峰的强度与肿瘤的大小成正比。体外实验证实,此蛋白为玻连蛋白的羧基末端,在HCC表达增高,可反映HCC的侵袭性。因此,玻连蛋白的羧基末端多肽可望成为HCC新的血清标记物。,利用血清蛋白质谱发现了能够提高结核诊断率的标志物,Application in Diagnosis,Application in mechanism,通过对HIV阳性患者及正常人外周血单核细胞差异性蛋白分析，得到黏着斑蛋白、裸蛋白等潜在标志物，促进了对HIV潜在机制的研究。,Application in Treatment,白血病： 白血病是血液系统的常见恶性肿瘤，临床上分型较多，而不同的亚型之间，所用的治疗方案不同，其预后结果也不相同，所以白血病的分型显得尤为重要。 为了明确急性白血病FAB分型中所涉及的关键蛋白，对61 例急性白血病患者进行筛查，发现髓系相关蛋白8和14仅在M2和M3型中高表达。因此，这两种标志物蛋白可以作为急性髓系白血病（AML）分型标志蛋白，有利于选择正确的治疗方案。,Application in Treatment,直肠癌： 蛋白质组学技术可用于直肠癌手术前分子分期，对判断结直肠癌的淋巴结转移、远处转移有重要意义。徐文鸿等应用SELDI-TOF-MS，分析了76 例结直肠癌患者的血清标本，建立并验证了分期模型。通过SELDI-TOF-MS 技术所筛选的候选肿瘤标志物可以指导大肠癌的综合治疗，所建立的诊断模型可以辅助临床明确大肠癌的术前分期。,网上蛋白质组学资源, 蛋白质组研究技术、信息等。 从新药开发角度，发现新蛋白及新作用。 可以找到蛋白质组研究相关企业、各种仪器来源、新闻等。teome.co.uk 各种蛋白质组研究相关信息 http:/www.micromass.co.uk 介绍蛋白质鉴定的先进仪器 .au 蛋白质鉴定专家系统，Australian Proteome Analysis Facilityhttp:/expasy.cbr.nrc.ca 蛋白质鉴定专家系统，Canadian Bioinformatics Resource,Introduction,Application,Research example,1,2,3,Investigation and Identification of disease-related peptide in sera from patients with chronic hepatitis B 慢性乙肝相关肝病差异蛋白的查找,选择研究的疾病,本研究：选择急慢性乙肝、肝硬化和肝癌 。,获取样品,血清,样品质量很重要：采血前要确认病人是否空腹采血和盛放血液装置无无机物、无任何抗凝或血沉物质等干扰实验。防止溶血、乳靡、絮状沉淀等血清样本在采血后3小时内处理并冷冻。血清分装后，-80储藏。-20 存放时间太长影响实验结果。,液体芯片分离蛋白,质谱分析,Clinprotools软件分析,差异蛋白发现,疾病诊断模型建立和诊断,急性乙型肝炎和慢性乙肝炎患者血清蛋白质组的比较,4210Da蛋白,图. MALDI-TOF 质谱分析得到的 4210Da图像. (A) 四组病人4210Da 蛋白的堆积图，ClinProtTools 2.1 软件分析。 (B) 四组病人中 4210Da的平均相对强度，ClinProtTools 2.1 软件分析 红色：急性肝炎 绿色 ：慢性肝炎 蓝色 ：肝硬化 黄色：肝癌 (C) SPSS 15.0 软件分析。,4210Da蛋白急性乙肝病人血清蛋白质组的追踪观察,慢性乙肝轻、中、重型患者血清蛋白质组的比较,1866Da蛋白,图1. 不同程度慢性肝炎病人的分布。 (A) 轻度 () 和中度 () 重叠比较多，可以联合到一组。 (B) 联合组 () 和重度组 () 可以明显的区分开。,1866Da蛋白在合并组和重型组具有明显差异,重型,合并,慢性乙肝（CHB）、肝硬化（LC）、肝癌（HCC）患者血清蛋白质组的比较分析,根据氨基酸序列，4210Da蛋白被鉴定为“Gene_Symbol=GSPT2 Eukaryotic peptide chain release factor GTP-binding subunit ERF.,4210蛋白氨基酸序列鉴定结果（36肽）,1866Da蛋白经检索鉴定为补体3的一个片段,4210Da多肽功能研究,eRF3b/GSPT2诊断价值的研究,血液提取RNA,荧光定量检测GSPT2的相对表达量,Fig. 1 The expression of GSPT2/18s RNA in blood of HBV-related diseases,Table 2 The expression of GSPT2/18s RNA in blood of normal control and HBV related diseases,Fig.2 Receiveroperator curves of blood GSPT2 in differentiating LC (left) and/or HCC (right) from CHB group. The area under the curve for GSPT2 is 0.738 (left) and 0.751 (right). The optimal values for GSPT2 in differentiating patients with LC from those CHB was 0.855, with a sensitivity of 95.2%, a specificity of 54.5%,LC,HCC,Fig.1 HE染色、免疫组化分析及GSPT2在HBV相关肝病患者血清中的表达. (A和C) 正常肝组织 (B和D) 肝癌组织; (E) GSPT2 mRNA在血液中的表达.,Fig.2 eRF3b 蛋白在各种细胞株中的表达. (A) eRF3b 和eRF3a 序列的比对，阴影部分多肽作为抗原用于抗体制备. (B)eRF3b在转染 pEFGP-C2 (C2), pEFGP-C2-GSPT1 (C2-GSPT1) and pEFGP-C2-GSPT2 (C2-GSPT2) 细胞中的表达. (C) eRF3b在各细胞株中 的表达 (1-9分别为 QSG-7701, HepG2, HepG2.215, RD, Hela, Hek293T, RPE, MDA-MB-231, U251).,4210Da多肽对Con A诱导的急性免疫性肝损伤的作用,Fig.1 The serum level of transaminase in mice pretreated with 37 amino acid polypeptide fragments before Con A injection.,Fig.2 HE staining results of liver tissue of mice pretreated with 37 amino acid polypeptide fragments before Con A injection (original magnification 10). Arrows indicate necrotic areas.,Fig.3 The survival rate of mice pre-treated with 37 amino acid polypeptide fragments at the lethal dose of Con A.,Fig.4 The apoptosis of liver cell after injected with Con A in mice which were pretreated with 37 amino acid polypeptide fragments.,Fig 5 The serum level of transaminase after injected with Con A in mice which post-treated with 37 amino acid polypeptide fragments.,Fig.6 HE staining results of liver tissue from mice treated with 37 amino acid polypeptide fragments after Con A injection (original magnification 10). Arrows indicate necrotic areas.,Fig.7 The survival rate of mice post-treated with 37 amino acid polypeptide fragments at the lethal dose of Con A.,1866Da多肽功能研究,细胞培养,用固相合成的多肽验证,新鲜血清经3Kd超滤管超滤之后刺激,不同程度肝炎病人的新鲜血清刺激,检查细胞的增殖,荧光定量PCR,刺激后提取细胞RNA,图1. 不同程度肝炎病人新鲜血清以及超滤血清对正常干细胞 QSG7701的影响。数值为增殖倍数的均数标准差。 (A) 新鲜血清刺激细胞后的增殖. (每组10例)。 (B) 超滤后仅含3KD以下蛋白的血清刺激细胞后的增值, (每组12例)。 Lane 1 为未刺激组, 2 为正常血清刺激组, 3 为轻中度混合组, 4 为重度血清刺激组. *P0.01, Group 3 versus 2 and 4.,图2.1866Da蛋白和 C3f 对肝细胞增殖的影响。 QSG-7701 种板 2000个/孔， 星状细胞 LX-02 6000个/孔，加入不同稀释浓度的1866Da蛋白以及 C3f培养48h. 数值为各浓度相对未刺激组的平均增殖倍数标准差。 (A) 对 QSG7701增殖的影响. DRC3f相邻的两浓度有差异，同时 DRC3f 组与 C3f组有差异，P0.05。,数据为三次试验的平均值，经 ANOVA 分析。P0.01 versus the other groups,1866Da蛋白对伴刀豆蛋白A诱导的急性免疫性肝损伤的作用,合并,Fig. 1 Effect of the sixteen-amino-acid peptide pretreatment on Con A- induced hepatitis in mice. (A) ALT and (B) AST were determined. Data is shown as meanSD ( n=8 mice per group). *P0.05, *P 0.01, *P0.001 vs. Con A group; +P0.05, +P0.01,+P0.001 vs. dexamethasone pretreatment group.,Fig. 2 Histological analysis was performed using HE staining: (a) normal group, (b) Con A group, (c) dexamethasone pretreatment group,(d, e, f, g) 200, 400, 800, 1600 g/kg body weight sixteen-amino-acid peptide pretreatment groups. Arrows indicate necrosis area, Scale bar, 50 m.,A,B,Fig. 3 Effect of the sixteen-amino-acid peptide pretreatment on Con A- induced hepatocytes apoptosis.,Sixteen-amino-acid peptide,Fig. 4 Effect of the sixteen-amino-acid peptide pretreatment on hepatocytes proliferation.,A,B,Fig. 5 Effect of the sixteen-a