人类X染色质小体的检测

1 人类人类 X 染色质小体的检测染色质小体的检测 摘要摘要 X 染色质小体 或称巴氏小体 性染色质小体 X 小体等 是指在哺乳动物体细胞核中 除一条 X 染色体外 其余的 X 染色体常浓缩成染色较深的染色质体的结构 本次实验用人 类口腔黏膜细胞和毛囊细胞为实验材料 用硫瑾染液染色 观察装片中的巴氏小体的形态 特征及存在部位等 得以掌握鉴定人类染色质的方法 在光学显微镜下 巴氏小体是一结 构致密 轮廓清楚染色质较深的小体 前言前言 X 染色质小体 或称巴氏小体 性染色质小体 X 小体等 是指在哺乳动物体细胞核中 除一条 X 染色体外 其余的 X 染色体常浓缩成染色较深的染色质体的结构 有袋类 偶蹄 类 翼手类 食肉类 灵掌类 包括人类 的多种组织的体细胞中 同样显示这种性别差 异 Barr 称之为为核仁随体 1948 年 Barr 以猫的神经元为材料 研究长时间刺激后神经元是否产生细胞学变化 在研究中 Bertram 观察到核仁附近有一种染色很深的小体 这种小体一些细胞有而一些细 胞无 这一现象引起了 Barr 的注意 他仔细查看了实验记录及标本 发现这种小体大多出 现在雌猫神经元中 雄猫神经元中则极少出现 即这种小体与性别有关 Barr 称这种小体 为 核仁随体 并推测小体是由两条性染色体的异染色质衍化来的 后来他以更多的哺乳 纲的代表性动物的不同组织做了观察 结果发现这些动物不同组织的体细胞中 同样显示 雌雄二型现象 dimorphism 观察 X 染色质小体数就成了检测 X 染色体数是否产生变异的 便捷方法 利用这一方法 对各类性畸形 智力缺陷 mental retardation 患者进行检测 1956 年后人类核型分析技术相对成熟 但 X 染色质小体检测仍旧是在人群中大规模筛 检 X 染色体数畸变个体的简便办法 最初检测 X 染色质小体用的是皮肤活体组织 取材不 便 Moor 与 Barr 1955 改用口腔黏膜上皮细胞进行检测取得了成功 1960 年 Ohno 和 Hauschka 发现 X 染色质小体实际上是一条在细胞分裂间期 收缩 的 异染色质化的 X 染色体 与核仁并无关系 也不是 Barr 推测的那样由两条性染色体各 贡献一部分异染色质形成 在一个个体中 不论其 X 染色体数目是几个 保持活性的仅一 个 也即 X 染色质数等于一个个体的 X 染色体数减 1 对于 X 染色体失活的机制 不同物种的剂量补偿方式及机制等问题进行了广泛 深入 地讨论 成了生物学研究的热点问题 据研究 X 染色体失活始于胚胎发育早期 在 X 染 色体长臂靠近着丝点的一段序列控制 X 染色体的失活 这段序列成为 X 染色体失活中心 X inactivation center XIC 将这段序列通过易位方式转移到常染色体 也能引起常染色 体失活 剂量补偿效应 指的是 XY 性别决定的生物中 使性连锁基因在两种性别中有相等或近 似相等的有效剂量的遗传效应 哺乳动物雌性个体的 X 染色体失活遵循 n 1 法则 不论有 多少条染色体 最终只能随机保留一条的活性 剂量补偿有三种不同的机制 1 哺乳类中 雌性个体的两条 X 染色体中的一条随机失活 雄性个体的 X 染色 体保留活性 2 在果蝇中 雄性 X 染色体上的基因转录活性加倍 使得其与拥有两条 X 染色 体的雌性果蝇在基因表达量上达到一致 2 3 秀丽隐杆线虫中两条 X 染色体的表达量均减半 使得其与一条 X 染色体的基 因转录活性一致 巴氏小体对于预测胎儿性别方面的应用 无论从计划生育的角度还是从避免遗传病的角度 对胎儿性别的早期诊断都有重要的 现实意义 早在 1949 年 巴尔便发现了男女细胞在性染色体上的差别 巴尔采用一种非常简便 的方法 即用女性的口腔粘膜或阴道粘膜涂片 经染色后在光学显微镜下观察 发现间期 细跑的细胞核内有一个约 1 2 0 7 微米大小 靠近核膜的浓缩染色质块 其数目比 x 染色 体数目少一个 正常女性细胞有 2 个 x 染色体 而只有一个性染色质 称为女性性染色质 又叫巴尔小体 巴氏小体 而男性因为只有一个 x 染色体 故无这种染色质块 但男性 细胞经用芥子喹咛因或荧光阿的平的酒精溶液染色 在荧光显徽镜下 可看到闪烁荧光的 y 小体 直径约 0 3 微米大小 又称男性染色质 只要有一个 y 染色体 便有一个 y 小体 这样 巴尔小体和 y 小体就把男女性别通过体细胞染色体检查区别得一清二楚 同时 也为性染色体病的检出提供了新方法 那么 对未降生的胎儿又是如何及早预知雌雄 以 便决定取舍呢 随着科学技术的进步 近几十年 科学工作者对胎儿性别的宫内诊断做了大量工作 国内外有关这方面的报道也不少 把这些方法归纳起来 检查的材料有羊水细胞 胎盘绒 毛膜细胞以及最近采用孕妇的血 尿 宫颈粘液等 检查的方法有 x 性染色体 嗜中性粒 细胞鼓缒体 性染色体 y 荧光小体 微量免疫扩散法等 预测胎儿性别最理想的要求 应当取材容易 操作简单安全 孕早期即能诊断 而 且正确率要高 以上方法各有优缺点 巴氏小体存在概率的参考值 正常女性口腔粘膜细胞中 X 染色质约 15 左右 平均 16 4 不超过 30 35 仅含 1 个 X 染色质 男性只有 0 3 平均 0 7 实验材料及仪器实验材料及仪器 显微镜 牙签 镊子 解剖针 载玻片 要非常干净 这样材料才能粘得比较牢 这一点 在用口腔黏膜上皮细胞制备 X 染色质小体时尤其重要 盖玻片 蒸馏水 45 醋酸溶液 1M HCl 硫瑾染液 操作步骤操作步骤 1 获取实验材料 口腔黏膜细胞口腔黏膜细胞 取一干净的载玻片 用记号笔在你即将涂细胞的一面作个标记 先用 水将口漱净 尽可能除去口中的杂物 然后用牙签钝头在口腔一侧用力刮取 弃去第 一次得到的刮取物 在用一部位继续刮取 这样可得到深层的表皮细胞 将刮得的细 胞涂抹在干净载片上 反复几次 使玻片上的材料尽量涂厚些 将载玻片在空气中晾 干 这样细胞就可以紧贴在玻片的表面 毛囊细胞毛囊细胞 拔取一根毛根比较的毛发 这毛发可用头发或其他部位 如手臂上的毛发 均可 如可能 尽量选用白色或浅颜色的毛发 这样在制片中就可减少色素的干扰 在一张干净的载玻片中央滴一滴 45 的醋酸 将毛根浸渍其中 静置约 5min 待毛根 稍软后可用镊子尖或解剖针将外层毛囊的组织细胞轻轻挂在一张干净的载玻片上 用 力太大 则可能将毛发上的色素细胞一起刮下 影响制片的效果 弃去毛干 用解剖 针将载玻片上的组织细胞摊平 摊平的材料在空气中晾干后再染色 3 2 染色 口腔黏膜细胞口腔黏膜细胞 将晾干的玻片放在 1M HCl 中解离 10min 吸去 HCl 用蒸馏水水洗 3 次 用硫瑾染液染色 10min 用蒸馏水漂洗干净 之后将载玻片晾干 至于显微镜下镜 检观察 毛囊细胞毛囊细胞 在晾干的波片上滴硫瑾染液染色 10min 加盖玻片 用吸水纸吸去多余染液 之后用解剖针敲片 使得细胞分散 压片观察 3 观察 实验结果及分析实验结果及分析 在光学显微镜下可见到 X 染色质为一结构致密 轮廓清楚染色较深的小体 人类的 X 染色质常附着于核膜内侧 这个位置就是晚复制的 X 染色体所处的位置 Morishima 1962 大小约在 1 m 左右 呈三角形 卵形 短棒形或双球形 一般说 来 在动物细胞中 X 染色质可以处于三种位置 靠近核仁 靠近核膜 或者自由地处于 核区内 这种 位置 对于每一种来说是相对固定的 4 如图所示 此细胞核中有两个巴氏小体 处于核膜内侧的 X 染色质在压片时完全可能被压在核的中央 这种情形下 X 染色质 很容易与核中其他的着色的结构相混 实验中应注意的问题 1 刮取口腔上皮时应先漱口 食物碎屑等会影响实验取材