基因工程重点

名词解释 名词解释 1 基因工程 基因工程 狭义的基因工程 狭义的基因工程 是指将一种生物体 供体 的基因与载体在体外进行拼接重组 然后转 入另一种生物体 受体 内 使之按照人们的意愿稳定遗传 表达出新产物或新性状 广义的基因工程 广义的基因工程 是指 DNA 重组技术的产业化设计与应用 包括上游技术和下游技术两 大组成部分 上游技术 基因重组 克隆和表达的设计与构建 即 DNA 重组技术 下游技术 基因工程菌 细胞 的大规模培养 外源基因表达产物的分离纯化过程 2 DNA 重组技术 重组技术 除少数 RNA 病毒外 几乎所有的基因都存在于 DNA 结构中 而用于 外源基因重组拼接的载体也都是 DNA 分子 因此基因工程也称为 DNA 重组技术 3 基因组文库 基因组文库 将某种生物基因组 DNA 经超声波或限制酶部分酶切处理后 与载体连接 转化宿主细胞 得到含全部基因的克隆群体 4 cDNA 文库 文库 将某种生物基因组转录的全部 mRNA 通过反转录合成 cDNA 与载体连 接 转化宿主细胞 得到含全部表达基因的克隆群体 5 PCR polymerase chain reaction 利用耐热 DNA 聚合酶的反复作用 通过变性 退火 延伸的循环操作 在体外迅速将 DNA 模板扩增数百万倍的操作技术 6 Southern 印迹杂交 印迹杂交 是将 DNA 分子从电泳凝胶转印到硝酸纤维素膜上 进行核酸杂交 的一种实验方法 7 基因诊断 基因诊断 通过检测致病基因 包括内源基因与外源基因 的存在 量的多少 结构变 化与否 表达水平是否正常 以确定被检查者是否存在基因水平的异常变化 以此作为疾 病确诊的依据 8 基因治疗 基因治疗 gene therapy 指将人的正常基因或有治疗作用的基因 通过一定方式导入 人体细胞 以纠正基因的缺陷或发挥治疗作用 从而达到治疗疾病目的的生物高技术 9 转基因动物 转基因动物 是人类按自己的意愿 借助基因工程技术 将外源基因导入动物受精卵 有目的 有计划 有根据 有预见地改变动物的遗传组成 使外源基因与动物基因组整合 在体内稳定表达并能稳定遗传给后代的动物 10 转基因技术 转基因技术 将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中 由于导入基因的表 达 引起生物体性状的可遗传修饰 这一技术称为转基因技术 简答题 简答题 一 基因工程的基本原理 基因工程的主体战略思想是外源基因的稳定高效表达 分子遗一 基因工程的基本原理 基因工程的主体战略思想是外源基因的稳定高效表达 分子遗 传学 分子生物学 生物化学工程学是基因工程原理的三大基石 传学 分子生物学 生物化学工程学是基因工程原理的三大基石 1 提高外源基因的剂量 DNA 复制及稳定遗传的分子遗传学原理 2 筛选 修饰 重组基因转录调控元件 基因表达调控的分子生物学原理 3 筛选 修饰 重组 mRNA 翻译调控元件 基因表达调控的分子生物学原理 4 基因工程菌 细胞 的增殖及稳定生产 生物化学工程学的基本原理 二 基因工程的理论依据二 基因工程的理论依据 1 不同基因具有相同的物质基础 2 基因是可切割的 3 基因是可以转移的 4 多肽和基因之间存在对应关系 5 遗传密码是通用的 6 基因可通过复制把遗传信息传给下一代 三 双脱氧链末端终止法的原理三 双脱氧链末端终止法的原理 1 在单链模板 引物 4 种 dNTPs 存在时 Klenow 酶能不断地将 dNTP 加到引物 3 OH 末端 合成出与单链模板互补的新链 2 Klenow 酶还能以 ddNTP 作为底物 使之掺入正在延伸的 DNA 链中 但因 ddNTP 缺少 3 OH 无法和下一个核苷酸之间形成磷酸二酯键 故在 ddNTP 掺入位置 链延长终止 四 基因文库的质量标准 四 基因文库的质量标准 除尽可能高的完备性外 理想的基因文库还应具备 1 克隆总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力 2 载体的装载量必须大于基因的长度 3 含有相邻 DNA 片段的重组克隆之间 需存在足够长度的重叠区 以利于克隆排序 4 克隆片段易于从载体分子上完整卸下 5 重组克隆能稳定保存 扩增 筛选 五 五 PCR 引物设计原则 引物设计原则 1 长度适宜 一般 15 30bp 2 G C 含量 40 60 3 4 种碱基应随机分布 4 内部不应存在互补序列 5 两条引物之间不应有多于 4 个碱基的互补 6 3 端不应有任何修饰 7 5 端可修饰 如 32P 生物素 荧光素 六 寡核苷酸探针的设计原则 六 寡核苷酸探针的设计原则 1 长度 18 50bp 2 G C 含量 40 60 3 分子内部不含互补区 4 避免同一碱基连续出现 不能多于 4 个 5 与非靶序列 70 以上同源性 或连续 8 个以上碱基序列相同 最好不用 七 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制七 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制 基因工程菌遗传不稳定性的表现主要为重组质粒的不稳定性 包括结构不稳定性和分配不 稳定性 工程菌遗传不稳定性的产生机制 工程菌遗传不稳定性的产生机制 1 受体细胞中的限制修饰系统对外源 DNA 的降解 2 外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢 3 受体细胞的内源性转座元件促进重组 DNA 的缺失 重排 4 重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配 八 选择分离纯化方法时 应遵循下列原则 八 选择分离纯化方法时 应遵循下列原则 1 选择不同分离纯化机理的方法联合使用 2 尽量选择高效的分离方法 3 首先选择能除去含量最多杂质的方法 4 将最费时 成本最高的分离纯化方法排在最后 九 酵母菌表达外源基因的优势 九 酵母菌表达外源基因的优势 1 全基因组测序 基因表达调控机理清楚 遗传操作简便 2 具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统 3 能将外源基因表达产物分泌至培养基中 4 大规模发酵工艺简单 成本低廉 5 不含特异性病毒 不产毒素 被美国 FDA 认定为安全的基因工程受体系统 酵母菌表达外源基因的缺点 酵母菌表达外源基因的缺点 表达产物的糖基化位点和结构特点与高等真核生物有差距 十 乳腺生物反应器的优点十 乳腺生物反应器的优点 1 产量高 2 活性高 表达产物经过充分的翻译后修饰加工 如糖基化 磷酸化和羧基化等 具有稳 定的生物活性 3 成本低 不需昂贵的生产设备 如发酵罐 动物饲养 繁殖成本比较低 4 周期短 5 效益高 论述题论述题 一 什么是密码子的偏爱性 生物体对密码子偏爱性的决定因素是什么 怎样进行纠正 一 什么是密码子的偏爱性 生物体对密码子偏爱性的决定因素是什么 怎样进行纠正 1 生物体对密码子的偏爱性 生物体对密码子的偏爱性 不同生物 甚至同种生物不同的蛋白质编码基因 对简并 密码子的使用频率不同 具有一定的偏爱性 2 生物体对密码子偏爱性的决定因素 生物体对密码子偏爱性的决定因素 生物基因组中的碱基含量 生物基因组中的碱基含量 在富含 AT 的生物 如单链 DNA 噬菌体 X174 基因组中 密码子第 3 位上 U 和 A 出现频率较高 在 GC 丰富的生物 如链霉菌 基因组中 第 3 位 上含 G 或 C 的简并密码子占 90 以上 密码子与反密码子相互作用的自由能 密码子与反密码子相互作用的自由能 适中的作用强度有利于蛋白质生物合成的迅速进 行 弱配对作用可能使氨酰基 tRNA 进入核糖体 A 位需要花费更多的时间 强配对作用则 可能使转肽后核糖体在 P 位逐出空载 tRNA 分子耗费更多的时间 细胞内细胞内 tRNA 的含量 的含量 简并密码子使用频率与相应 tRNA 的丰度呈正相关 表达量高的 基因含有较少种类的密码子 这些密码子又对应于高丰度的 tRNA 分子 以便细胞能以更 快的速度合成需求量大的蛋白质 对于需求量少的蛋白质 其基因含有较多与低丰度 tRNA 相对应的密码子 用于控制该蛋白质的合成速度 密码子偏爱性对外源基因表达的影响 密码子偏爱性对外源基因表达的影响 原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率有 较大差异 因此哺乳动物基因在 E coli 中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择 3 使外源基因上的密码子在 使外源基因上的密码子在 E coli 中获得最佳表达的策略 中获得最佳表达的策略 外源基因全合成 外源基因全合成 按 E coli 密码子的偏爱性规律 更换外源基因中不适宜的简并密码子 同步表达相关同步表达相关 tRNA 编码基因 编码基因 对于那些含有密码子种类单一 出现频率较高 而本身 分子量又较大的外源基因 则选择相关 tRNA 编码基因同步克隆表达的策略 二 鼠源单抗的缺点及其改进措施二 鼠源单抗的缺点及其改进措施 鼠源单克隆抗体的缺点 鼠源单克隆抗体的缺点 1 重复用药会产生抗鼠抗体 降低疗效 2 分子量大 在体内 穿透血管的能力差 3 生产成本高 不适合大规模工业化生产 解决措施 通过基因工程 将鼠源单克隆抗体进行改造 解决措施 通过基因工程 将鼠源单克隆抗体进行改造 基因工程抗体 基因工程抗体 采用基因工程方法 对免疫球蛋白基因进行切割 拼接或修饰后 导入受 体细胞进行表达 产生新型抗体 基因工程抗体分类 基因工程抗体分类 人源化抗体 嵌合抗体 改型抗体 完全人源化抗体 小分子抗体 Fab 抗体 单链抗体 单域抗体 超变区多肽抗体 1 人源化抗体 人源化抗体 1 嵌合抗体 嵌合抗体 chimeric antibody 从杂交瘤细胞分离出鼠功能性可变区基因 与人 Ig 恒定 区基因连接 插入适当表达载体 转染宿主细胞 表达人 鼠嵌合抗体 特点 特点 降低了鼠源性抗体的免疫原性 同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力 2 改型抗体 改型抗体 reshaped antibody Rab 为降低来自鼠可变区中骨架区的免疫原性 Winter 克隆出鼠源抗体中与抗原结合的 3 个互补决定区 CDR 基因 以置换人抗体中的相应序列 特点 特点 绝大部分为人源性 只有 CDR 区来自小鼠 又称 CDR 移植抗体 对人体几乎无免 疫原性 3 完全人源化抗体 完全人源化抗体 以人的抗体基因置换小鼠的全套抗体基因 通过抗原物质刺激小鼠 表达出人源特异性抗体 2 小分子抗体 小分子抗体 是具有抗原结合功能的小分子片段 是针对完整抗体的分子量大 不易透 过血管壁等不足而进行改进的 1 Fab 抗体 抗体 由重链 VH 区及 CH1 区与轻链以二硫键形式连接而成 大小只有完整抗体 的 1 3 具有完整抗体完全相同的抗原结合能力 2 单链抗体 单链抗体 single chain of Fv ScFv 由抗体重链和轻链的可变区 VH 和 VL 通过连接肽 重组并表达的一种抗体 大小只有完整抗体的 1 6 特点 特点 抗原结合能力好 分子量小 穿透性强 体内循环半衰期短 免疫原性低 3 单域抗体 单域抗体 只有 V 区基因小片段 分子量仅为完整抗体的 1 12 4 超变区多肽抗体 超变区多肽抗体 根据抗体分子中与抗原特异性结合区域的氨基酸序列 设计具有对特 异性抗原识别与结合的多肽分子 一般只有几十个氨基酸 三 基因工程的应用三 基因工程的应用 A 在医学上的应用 在医学上的应用 一 基因工程药物 基因工程被用于大量生产过去难以得到或几乎不可能得到的蛋白质 肽类药物 基因工程疫苗将帮助人类彻底战胜疫病 二 基因诊断 三 基因治疗 B 在农业上的应用 在农业上的应用 一 转基因植物 抗病虫害 抗逆 提高产量 改良品质 提高固氮效率 药物和疫苗 的新载体 提高花卉的观赏价值 二 转基因动物 生产药物 人工改良牛奶 培育动物优良品系 器官移植 观赏动物 C 在工业上的应用 在工业上的应用 制药工业 食品工业 酶制剂工业 酿酒工业 冶金工业 D 在能源和环保上的应用 在能源和环保上的应用 一 解决能源危机 乙醇 最有希望的替代能源 氢气或沼气 白色能源 石油 黑色能 源 二 环境保护 环境监测 环境污染治理 构建能降解有机污染物的工程菌 分解石油 吞噬汞 降解土壤中的 DDT E 基因工程对经济社会发展的影响 基因工程对经济社会发展的影响 提高生命质量 延长人类寿命 改善农业生产 解 决食品短缺 制造工业原料 生产贵重金属 解决能源危机 治理环境污染 四 谈谈基因工程是一把双刃剑四 谈谈基因工程是一把双刃剑 一 基因工程的应用 同上 一 基因工程的应用 同上 二 基因工程的安全性问题 二 基因工程的安全性问题 1 将外源基因引入人体 可能会破坏细胞生长的重要基因 也可能