Western印迹要想做的好

Western 印迹要想做的好 当然每个步骤都不能马虎 一 配胶 这些小孔的孔径随 双丙烯酰胺 丙烯酰胺 比率的增加而变小 比率接近 1 20 时孔 径达到最小值 SDS 聚丙烯酰胺凝胶大多按 双丙烯酰胺 丙烯酰胺 为 1 29 配制 试 验表明它能分离大小相差只有 3 的蛋白质 分离胶及浓缩胶均可事先配好 除 AP 及 TEMED 外 过滤后作为储存液避光存放于 4 可至少存放 1 个月 临用前取出室温平衡 否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储 存液中的气体析出而导致气泡 有条件者可真空抽吸 3 分钟 加入 10 AP 0 7 0 8 100 分离胶浓度越高 AP 浓度越低 15 的分离胶可用到 0 5 100 及 TEMED 分离胶用 0 4 1000 15 的可用到 0 3 1000 浓缩胶用 0 8 1000 PAGE 配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响 这个配胶的比例 在 分子克隆 上有详细的论述 相信大家都不难查到 容易忽视的问题主要在于过硫酸 铵 AP 一定要新鲜 最好用小指管配 AP 写日期 保存在 20 度 超过 2 周的 AP 扔 掉算了 或者已经反复打开使用多次的 AP 都别用 灌入 2 3 的分离胶后应立即封胶 胶浓度 10 时可用 0 1 的 SDS 封 浓度 10 时用水 饱和的异丁醇或异戊醇 也可以用 0 1 的 SDS 封胶后切记 勿动 如用醇封胶需用大量清水及 ddH2O 冲洗干净 然后加少量 0 1 的 SDS 目的是通过降低 张力清除残留水滴 10 的 AP 最好现配现用 如在 4 存放勿超过两周 30 的丙烯酰胺如有沉淀 最好弃掉 过硫酸铵 APS 10 w v 取 3g 过硫酸铵 溶于去离子水 至终体积为 30mL 此溶液 4 下在短暂的数日内是稳定 的 但建议 对每一组新胶均应新鲜配制 但摇动溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气 二 样品处理 先制备蛋白样品 后灌注压缩胶 压缩胶灌注后应在 20 40min 内使用 上样前蛋白样品最好离心 上样量不宜过多 以免看结果时 每个条带都弯弯地 笑 你 贪多嚼不烂哦 其他的操作 按照说明控制电流 不要过多重复使用电泳 Buffer 别小气 重复使用会降低缓冲能力的 好像基本不会出问题了 当预染的 Marker 告诉你 你要分 辨的蛋白已经到达最佳分辨区 分离胶的 2 3 处 OK 电泳结束了 电泳样品假如样品缓冲液后 要在沸水中煮 3 5 分钟使 SDS 与蛋白质充分结合形成 SDS 蛋 白质复合物 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子 可以自由通过凝胶孔径 所以它显示着电泳的前沿位置 当 指示剂到达凝胶底部时 即可停止电泳 另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增 大溶液密度 使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部 样品制备是关键步骤 要求尽可能的获得所有蛋白质 应注意以下问题 1 在合适的盐 浓度下 应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性 2 选择合适的表面活性剂和还原剂 破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键 使其形成一个各自多肽的溶液 3 尽量去除核酸 多糖 脂类等干扰分子 4 防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修 饰 制备过程应在低温下进行 以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰 建议加入合适 的蛋白酶抑制剂 5 样品建议分装成合适的量 然后冷冻干燥或直接以液体状态置 80 中保存 但要注意不要反复冻融 三 电泳 所有蛋白样品调至等浓度后上样 样品两侧的泳道用等体积的 1 loading buffer 上样 Marker 也用 1 loading buffer 调整至与样品等体积 低电压短时间的预电泳 恒压 10 20V 20 30min 清除凝胶内的杂质 疏通凝胶孔径以保 证电泳过程中电泳的畅通 以初始电压为 45V 时的电流强度进行稳流电泳 当电压达 65V 时改为稳压电泳 注意加样时间要尽量短 以免样品扩散 为避免边缘效应 可在未加样的孔中加入等量的 样品缓冲液 凝胶上所加电压为 8V cm 当染料前沿进入分离胶后 把电压提高到 15V cm 四 转膜 由于转膜过程中的气泡问题对于实验结果有很大的影响 Western Blot 试验宝典 将 PVDF 膜先在甲醇中浸泡几分钟 再转移到转膜缓冲液中处理 15min PVDF 膜 125 200 ug cm2 适合于 SDS 存在下与蛋白质的结合 另外提醒一句 由于 NC 膜上结合的蛋白会因为一些去污剂而被代替 因此在封闭时最好 使用较温和的 Tween20 而且浓度不要超过 0 3 据说 0 05 效果最好 PVDF 膜特别注意的是需要 100 甲醇预处理 不超过 15 秒 再用缓冲液平衡 才能用 如果 WB 前没有可参考的资料 比如不知道是否有表达 比如抗体少还要摸条件 稀释 度 可以用剪膜剩下的边角料来先做几组点杂交摸条件 省点时间省点试剂 切个小角是常用的方法 膜上要做好标记 识别正反面和上下 膜彻底浸润后颜色会变深一点 任何白点或者斑都是没有完全浸润的标志 会影响转膜的 半干电转移要防止过热 转膜后 膜上其他的空白位置需要用封闭液封闭 Western 的灵敏度某种程度上受限于封 闭做的好不好 切记 封闭时间和封闭剂的量都要足够 封闭不完全 后面就全白忙活了 五 封闭及杂交 可以遵从以下原则 单抗专一性高 但是经过 SDS PAGE 变性胶电泳的蛋白质可能由于原 来的识别位点构象发生改变而不被识别 多抗不如单抗专一性高但更容易得到结果 一抗的稀释度通常需要预实验摸条件 可以根据说明书上建议的 WB 稀释度附近做 2 3 个梯度 如果是用化学发光法检测 由于灵敏度高而建议将稀释度再放大一些 反贴法的操作 含一抗的封闭液滴加于摇床的塑料膜上 将 Western 膜从封闭液中取出 滤纸贴角稍吸干 正面朝下贴在一抗上 注意不要留下气泡 室温下轻摇孵育一小时或 4 静置过夜 在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体过多蒸发 封闭液与抗体溶剂均为含 5 脱脂奶粉的 PBST 或 TTBS 临用时取 200ml PBST 或 TTBS 加入 10g 脱脂奶粉即为封闭液 一抗溶液中加入 0 2 叠氮钠后可 4 存放至少 2 周 一个月我也用过 没问题 再长时 间还没试 六 发光鉴定 一般的 WB 检测过程中 都会有封闭 一抗 二抗和底物显色这四道工序要 加工 我 个人觉得底物显色这最后一步是最关键的 也是最有文章可以作的一个部分 化学发光 Chemiluminescent 和底物显色 Colormetirc Chromogen 前者灵敏度很高 随着 各大厂家努力开发研制灵敏度更高的发光底物 化学发光法的灵敏度已经达到 pg 级别 甚 至还有 Femto 级别的 灵敏度超过了同位素 而后者由于直接显色而操作简便且成本低 最为大家熟悉当数辣根过氧化物酶 HRP Horseradish Peroxidase 属于过氧化物酶 POD 类 和碱性磷酸酶 AP Alkaline Phosphatase 最熟悉的底物应该是 3 3 二氨基联苯胺 DAB DAB 可以和 HRP 作用形成褐色不溶性产物 灵敏度高 特异性好 缺点就是需要现配现用 显色后光照数小时会褪色 不能永久保存 需要拍照记录 而且有毒 DAB 的选择有一点小小的技巧 3 3 二氨基联苯胺 4 盐酸盐 的纯品分子量为 360 1 通常是深棕色粉末 不太好溶于水 容易得到有色颗粒的溶液而导 致膜上的背景 而且价格还被炒得贵 但是如果选择 2 水合 3 3 二氨基联苯胺 4 盐酸盐 分子量 396 14 就是白色粉末状晶体 易溶 溶液无色均匀 量大价格还便宜 HRP 化学发光反应底物 化学发光法由于仅在酶和底物都存在的时候才会发光 不同于生 色反应般形成不溶的产物于膜上累积 所以特别适合同一张膜对不同的目标蛋白分别进行 多次检测 分子克隆 III 推荐的 AP 适用封闭剂是 6 的酪蛋白 1 聚乙烯吡咯烷酮 10mmo lEDTA 65 度加热一小时确保 AP 失活后再用于封闭 所以选择正确的蛋白 Marker 也是 Wb 实验成功的必要条件之一 在选择上来说 当然是选择其中至少有一条条带和自己的目的蛋白大小相近的最好 越近 越好 多次反复冻融对于蛋白的危险 不用多说吧 这种预染蛋白分子量标准可以帮助我们在电泳时 电泳后 以及转膜后监测电泳情况和估 计迁移率 真的有这样一种产品 抽掉了 WB 中费时的非必需步骤 转膜和封闭 直接在 PAGE 电 泳胶上做免疫印迹 这个几乎颠覆传统 WesternBlot 概念的技术创新 完美演绎了 没有 做不到 只有想不到 这一句话 注意事项 1 免疫印迹杂交的敏感与检测系统有关 因此 凝胶电泳时的蛋白上样量应该保证被检测抗 原量不至于太低 如果过低应该重新纯化和浓缩使用 或者建议做一次剃度稀释 上样电泳后 直接考马斯亮蓝染色选择最佳上样量 纯化和浓缩的蛋白质样品必须注意盐的浓度过高 可平 衡一下盐的浓度 如 透析 2 形成凝胶的试剂要有足够的纯度 激活剂的浓度适当 不仅可以决定凝胶聚合的速度 也将 影响凝胶的质量 聚胶时的温度也将影响凝胶聚合的速度 因此 建议要根据不同温度下适量 增减激活剂的用量以保证分离胶从加入激活剂起至开始出现凝胶凝聚的时间为 15 20 分钟 最佳 对于浓缩胶最佳聚合时间为 8 10 分钟开始可见聚合 灌完分离胶加水封闭分离胶与外 界氧气的结合 3 未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性 操作时应该戴手套防护 梳子插入浓缩胶时 应确保没有 气泡 可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生 梳子拔出来时应该小心 不要破坏加样孔 如 有加样孔上的凝胶歪斜可用枕头插入加样孔中纠正但要避免枕头刺入胶内 4 电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的旗袍和未聚合的丙烯酰胺 同时建 议低电压短时间的预电泳 清除凝胶内的杂质 疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通 恒压 10 20V 20 30min 5 加样前样品应先离心 尤其是长时间放置的样品 以减少蛋白质带的拖尾现象 6 为避免边缘效应 可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液 7 样品缓冲液中煮沸的样品可在 20 存放数 但是反复冻融会使蛋白质降解 8 为减少蛋白质条带的扩散 上样后应尽快进行电泳 电泳结束后也应直接或者转印 9 上样时 小心不要使样品溢出而污染相临加样孔 10 取出凝胶后应注意分清上下 可用刀片切去凝胶的一角作为标记 如左上角 转膜时也应 用同样的方法对 NC 膜做上标记 如左上角 以分清正反面和上下关系 11 转膜时应依次放好 NC 膜与凝胶所对应的电极 即凝胶对应负极 NC 膜对应正极 Western Blot 原理宝典 现常用的有底物化学发光 ECL 和底物 DAB 呈色 体同水平和实验条件的是用第一种方法 目前发表文章通常是用底物化学发光 ECL 我的样品的蛋白含量很低 每微升不到 1 微克 但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白 转到了膜上 就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在 只是颜色变淡了 有什 么办法可以解决 解答 你可以加大上样量 没有问题 还有转移时你可以用减少电流延长时间 多加 5 10 甲醇 有什么方法可以提高上样量 解答 可以浓缩样品 增大上样体积来增大上样量 一抗 二抗的比例是否重要 解答 比较重要 调整好一抗 二抗的比例 可以去掉部分非特异的本底 在做 Western Blot 时 PBDF 膜用甲醇浸泡的目的 解答 PVDF 膜用甲醇泡的目的是为了活化 PVDF 膜上面的正电基团 使它更容易跟带负 电的蛋白质结合 做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的 影响跑胶跑的质量 有以下几个因素 1 电压 小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发 挥 电压越小 条带越漂亮 浓缩胶 80v 分离胶 100v 就能跑得很好 2 胶的均匀度 胶越均匀 条带越窄 分离越均匀 倒胶之前 一定要充分混匀 玻璃板一定要干净 双 蒸水隔离时 一定要比较轻地加上去 避免稀释上层的分离胶 使胶不均匀 一般电泳是积层胶 60 80v 分离胶 100v 三个关键步骤 1 蛋白定量必须用仪器 肉眼不准 保证每孔加样量 20ul 以上 2 转膜效率低 建议隔夜 必须上预染 marker 否则难以判断成功与否 3 抗体浓度太低 建议一抗 1 250 二抗 1 2500 时间分别为室温 2 小时和 1 小时 实验题目 免疫印迹 实验题目 免疫印迹 Western blotting 教 师 XXX 实验类型 综合 学 时 16 参考 内 容 一 实验目的 免疫印迹主要用于蛋白质的结构和活性检测等方面 学生掌握与免疫印迹相关的原理和方 法 如电泳技术 转膜技术等 二 实验原理 蛋白质印迹 Western blotting 是将蛋白质转移并固定在化学合成膜的支撑物上 然后 以特定的亲和反应 免疫反应或结合反应及显色系统分析此印迹 蛋白质印迹 免疫印迹 的实验包括 5 个步骤 1 固定 immobilization 蛋白质进行聚 丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE 并从胶上转移到硝酸纤维素膜上 2 封闭 blocked 保持膜上没 有特殊抗体结合的场所 使场所处于饱和状态 用以保护特异性抗体结合到膜上 并与蛋白 质反应 3 初级抗体 第一抗体 是特异性的 4 第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性 结合并作为指示物 5 适当保温后的酶标记蛋白质区带 产生可见的 不溶解状态的颜色 反应 三 试剂与器材 试剂 1 人 IgG 免疫兔的抗血清 2 辣根过氧化酶一羊抗兔 IgG 3 PBS 缓冲液 NaCl 8 g KCl 0 2 g KH2P04 O 24 g Na2HP04 12H20 2 9 g 加蒸馏 水至 1000 ml pH 值为 7 4 4 PBS T 缓冲液 PBS 缓冲液加 O 05 9 6 Tween 20 5 封闭液 0 5 质量分数 BSA 用 PBS 缓冲液配制 6 底物溶液 A 液 溶解 30 mg CN 在 5 ml 甲醇中 B 液 溶解 10 mg DAB 在 5 ml 甲醇中 C 液 分别搅拌 A 液和 B 液 10 15 rain 直到完全溶解 然后将 A 液和 B 液混合 加 PBS 至 50 ml 分成 10 ml 一份 不用的可冷冻 一 20 C 下次直接化冻运用 D 液 取 10 ml C 液 运用时加 10 ml 30 体积分数 H202 7 转移缓冲液 0 025 mol L Tris O 192 mol L 甘氨酸 glycine 20 体积分数 甲醇 methan01 pH 值为 8 3 器材 1 半干转移槽 2 电泳仪电源 直流稳压 500 V 150 mA 四 操作方法 1 SDS PAGE 将待检测的抗原粗提取液 纯化过程中的样品或纯化后的样品以及标准相对分子质量 蛋白质等用 SDS PAGE 分离 2 转移蛋白质到硝酸纤维素薄膜上 1 准备转移缓冲液 2 切割与胶尺寸相符的硝酸纤维素薄膜 并用转移缓冲液浸湿 放置 15 min 直到没有气泡 3 切割 8 张普通滤纸 其大小与胶尺寸大小相符 并将其浸泡在有转移缓冲液的培养皿中 与硝酸纤维素薄膜分开浸泡 4 电泳后 切取有用部分的胶 并很快地在转移缓冲液中洗涤 5 打开蛋白质转移槽的盖板 依次放入 4 张用转移缓冲液浸泡过的滤纸 用转移缓冲液洗过的胶 并小心地赶走滤纸和胶之间的所有气泡 放上硝酸纤维素膜 另 4 张用转移缓冲液浸泡过的滤纸 6 小心地合上转移槽的盖板 7 插入电极 注意正负极方向 硝酸纤维素膜面向阳极 打开电泳仪开关 调至胶的面积 cm2 O 8 mA 1 5 2 h 8 转移结束后打开盖板取出硝酸纤维素薄膜 3 免疫印迹膜的处理 1 用 PBS 缓冲液洗膜 5 10 rain 2 将膜用封闭溶液封闭 用摇床轻摇 37 60 rain 3 用 PBS 缓冲液洗膜 3 次 每次 10 rain 4 将膜置于第一抗体溶液 小牛血清免疫兔的抗血清 1 10 中 置摇床上轻摇 37 摇 动 2 h 或 4 过夜 5 去掉第一抗体溶液 并用 PBS 洗膜 3 次 每次 10 min 6 将膜置于辣根过氧化酶一羊抗兔 IgG 溶液 1 500 中 37 轻摇 2 h 7 去掉辣根过氧化酶一羊抗兔 IgG 溶液 并用 PBS T 洗膜 3 次 每次 10 min 8 最后用 PBS 溶液洗 以转移 Tween 20 9 加底物溶液反应 2 10 rain 至抗原区带显色清楚为止 10 用去离子水洗涤 以终止反应 将膜夹在滤纸间 干燥 置暗处保存 另外 加底物溶液的显色反应 亦可用增强化学发光法 enhanced chemiluminescenceECI 代替 以增加其灵敏度 即将膜经 ECL kits 处理后 用放射自显 影法在 X 光片上留下清晰的图像 五 关键步骤与注意事项 1 注意安全 一些试剂对人体有害 如丙烯酰胺 放射性同位素等 2 避免样品污染 免疫印迹操作步骤免疫印迹操作步骤 1 主要内容 检测限为 2 20fmol 或约 0 1 lng 的 50kDa 蛋白质 有多个操作步骤 需 2 天 或 1 天 时间完成 检测抗原的存在 定量及其大小 半定量至全定量 抗原的检测依赖于耐变性的表位 一般 低亲和力抗体亦可使用 2 操作步骤 1 将蛋白质溶解于 Laemmli 样品缓冲液中 最终的样品缓冲液条件是 2 SDS 100mmol LDTT 从 lmol L 的储存液中取出 临用前加入 该储存液置于 20 冷冻保存 60mmol LTris pH6 8 0 01 溴酚蓝和 10 甘油 全细胞可直接放在 样品缓冲液中进行溶解 纯化或部分纯化的溶液可用 2 的样品缓冲液 1 1 进行稀释 加 热至 70 10min 最终蛋白质浓度应不超过 150ug 每孔 微型胶不超过 15pg 每孔 2 将样品放在 SDS 聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳 移去平板 将凝胶剪成适当大小以进 行转印 在凝胶上作记号以确定方向 3 剪 1 张硝酸纤维素膜和 4 张吸附滤纸 Whatman 3MM 或替代物 其大小与凝胶相当 4 将硝酸纤维素膜放入蒸馏水中润湿 将膜转入转印缓冲液中浸泡 5min 将吸水纸浸 泡于转印缓冲液中 转印缓冲液 1 20 000 400 000kDa 蛋白质 48mmol LTris 390mmol L 甘氨酸 0 1 w v SDS 20 甲醇加蒸馏水至 1000ml 转印缓冲液 2 100 000kDa 的蛋白质 先在 28V 转印 1h 然后 在 84V 转印 14 16h 分子质量 100 000kDa 的蛋白质 63V 转印 4 16h 8 转印完成后 断开电源 卸下夹层组合装置 并在硝酸纤维素膜上作记号以保持原 来的方向 9 用 PBS 将膜清洗数次 10 在室温下将膜放入 5 脱脂奶粉 PBS 中搅动孵育 2h 然后从封闭液中取出印迹 膜并用 PBS 漂洗 2 次 每次 5min 11 加入一抗溶液 15cmXl5cm 印迹膜用 10ml 所有的溶液均用 3 BSA PBS 进行 稀释 12 在室温下将膜和抗体搅动孵育 1h 用 PBS 将膜漂洗 4 次 每次换液洗 5rain 13 加入辣根过氧化物酶标记的二抗试剂 所有的溶液均用 3 BSA PBS 进行稀释 对组织培养上清可以不稀释或 1 10 稀释 这样获得的抗体浓度为 1Ps ml 和 50ug ml 如果是多克隆抗血清或腹水 将 10ul 稀释至 10ml 即可 如果抗体的浓度尚未知 需作若 干稀释度以确定正确的浓度范围 14 在室温下搅动孵育 1h 用 PBS 将膜漂洗 4 次 每次换液洗 5min 15 在临用前 新鲜配制化学发光试剂 由于该试剂的半衰期非常短 故应按需配制 将膜放入此液内孵育 lmin 16 用纸巾吸去印迹膜边缘或边角部分过多的化学发光试剂 将印迹膜放入塑料袋中 以确保干的表面与胶片接触 17 将印迹膜在暗室中使胶片曝光 lmin 冲洗胶片以确定待测抗原的正确曝光时间 曝光时间可短至几秒钟 也可长达数小时 Western Blot 免疫印迹法免疫印迹法 主要包括以下 4 个基本步骤 n 样品制备 n 电泳分离 n 蛋白的膜转移 n 免疫杂交与显色 蛋白检测 溶液和试剂 n 1X 磷酸盐缓冲液 PBS n Modified RIPA buffer Tris HCl 50 mM pH 7 4 NP 40 1 Na deoxycholate 0 25 NaCl 150 mM EDTA 1 mM PMSF 1 mM Aprotinin leupeptin pepstatin 1 microgram ml each Na3VO4 1 mM NaF 1 mM n 1X SDS 样品缓冲液 62 5 mM Tris HCl pH 6 8 于 25 C 2 w v SDS 10 甘油 50 mM DTT 0 01 w v 溴 酚蓝 n 转移缓冲液 25 mM Tris base 0 2 M 甘氨酸 20 甲醇 pH 8 3 n 10X Tris 缓冲盐 TBS 准备 1L 10X TBS 24 2 g Tris base 80 g NaCl 用 1N HCl 调 pH 为 7 6 n 脱脂奶粉或 BSA n 甲醇 n TBS T 缓冲液 1X TBS 0 1 Tween 20 n 封闭缓冲液 TBS T 1X TBS 0 1 Tween 20 加 5 w v 脱脂奶粉或 BSA n 一抗的稀释 1X TBS 0 1 Tween 20 加 5 BSA 多抗 或 5 脱脂奶粉 单抗 Note 一般来说 BSA 被推荐用于多克隆抗体 脱脂奶粉用于单克隆抗体 这样可得到 较高的信噪比 抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定 n 预染的蛋白质 Marker 可用于监测转膜的效率 样品制备 原始样品可为细胞 组织 培养上清 免疫沉淀或亲和纯化的蛋白 以下为定性检测 目的蛋白时细胞样品的处理方法 其余的样品制备方法参阅相关文献 1 培养细胞或药物处理 2 弃培养基 用 1X PBS 漂洗细胞 2 次 去尽残留培养基 3 加入 1X SDS 样品缓冲液 6 well plate 100 l w 或 75 cm2 plate 500 1000 l 瓶 刮落细胞 转移到 Ep 管 注意 冰上操作 4 超声 10 15 秒剪切 DNA 以减低样品粘性 5 煮沸样品 5 minutes 6 离心 12000g 5 min 取上清 7 电泳分离 上样 15 l 20 l 至 SDS PAGE 胶 10 cm x 10 cm 电泳 如要定量检测某蛋白的表达水平 应用 RIPA 裂解液 1 ml per 107 cells 100 mm dish 150 cm2 flask 裂解细胞 收集裂解液至离心管中 在振荡器上混匀 4 15min 14000g 离心 15min 4 弃沉淀 用 Bradford 法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以 调整上样体积和上样量 进行 Western 杂交时还需设置内或外参照 通常用 beta actin 注意 一般上样 20 30 g 已足够 如待检蛋白为低丰度蛋白 可加大上样量至 100 g 但电泳条带易拖尾 可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法 电泳分离 参照 SDS PAGE 电泳方法 转膜 杂交膜的选择是决定 Western blot 成败的重要环节 应根据杂交方案 被转移蛋白的 特性以及分子大小等因素 选择合适材质 孔径和规格的杂交膜 用于 Western blot 的膜 主要有两种 硝酸纤维素膜 NC 和 PVDF 膜 NC 膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物 在低离子转移缓冲液的环境下 大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力 的结合在一起 但在非离子型的去污剂作用下 结合的蛋白还可以被洗脱下来 根据被转 移的蛋白分子量大小 选择不同孔径的 NC 膜 因为随着膜孔径的不断减小 膜对低分子 量蛋白的结合就越牢固 通常用 0 45 m 和 0