Western blot

Western Blot 详解详解 原理 分类 试剂 步骤及问题解答原理 分类 试剂 步骤及问题解答 Western 免疫印迹 免疫印迹 Western Blot 是将蛋白质转移到膜上 然后利用抗体进 是将蛋白质转移到膜上 然后利用抗体进 行检测 对已知表达蛋白 可用相应抗体作为一抗进行检测 对新基因的表达行检测 对已知表达蛋白 可用相应抗体作为一抗进行检测 对新基因的表达 产物 可通过融合部分的抗体检测 产物 可通过融合部分的抗体检测 W We es st te er rn n 杂杂交交是是将将蛋蛋白白质质电电泳泳 印印迹迹 免免疫疫测测定定融融为为一一体体的的特特异异性性蛋蛋白白质质的的 检检测测方方法法 其其原原理理是是 生生物物中中含含有有一一定定量量的的目目的的蛋蛋白白 先先从从生生物物细细胞胞中中提提取取 总总蛋蛋白白或或目目的的蛋蛋白白 将将蛋蛋白白质质样样品品溶溶解解于于含含有有去去污污剂剂和和还还原原剂剂的的溶溶液液中中 经经 S SD DS S P PA AG GE E 电电泳泳将将蛋蛋白白质质按按分分子子量量大大小小分分离离 再再把把分分离离的的各各蛋蛋白白质质条条带带原原位位转转 移移到到固固相相膜膜 硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜或或尼尼龙龙膜膜 上上 接接着着将将膜膜浸浸泡泡在在高高浓浓度度的的蛋蛋白白质质 溶溶液液中中温温育育 以以封封闭闭其其非非特特异异性性位位点点 然然后后加加入入特特异异抗抗性性体体 一一抗抗 膜膜上上 的的目目的的蛋蛋白白 抗抗原原 与与一一抗抗结结合合后后 再再加加入入能能与与一一抗抗专专一一性性结结合合的的带带标标记记的的 二二抗抗 通通常常一一抗抗用用兔兔来来源源的的抗抗体体时时 二二抗抗常常用用羊羊抗抗兔兔免免疫疫球球蛋蛋白白抗抗体体 最最 后后通通过过二二抗抗上上带带标标记记化化合合物物 一一般般为为辣辣根根过过氧氧化化物物酶酶或或碱碱性性磷磷酸酸酶酶 的的特特异异 性性反反应应进进行行检检测测 根根据据检检测测结结果果 从从而而可可得得知知被被检检生生物物 植植物物 细细胞胞内内目目的的 蛋蛋白白的的表表达达与与否否 表表达达量量及及分分子子量量等等情情况况 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下 Western Blot 技术技术 一 原理一 原理 二 二 分类分类 i 放射自显影放射自显影 ii 底物化学发光底物化学发光 ECL iii 底物荧光底物荧光 ECF iv 底物底物 DAB 呈色呈色 本实验室使用本实验室使用 三 三 主要试剂主要试剂 四 四 主要步骤主要步骤 1 上样与电泳 冷却到室温后 把蛋白样品直接上样到 SDS PAGE 胶加样孔内即可 为了便于观察电泳效果和转膜效果 以及判断蛋白分子量大小 最好使用预染 蛋白质分子量标准 电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳 而在溴酚蓝进入下层胶时使 用高电压恒压电泳 对于 Bio Rad 的标准电泳装置 或类似电泳装置 低电压可 以设置在 80 100V 高电压可以设置在 120V 左右 SDS PAGE 可以采用普通 的电泳仪就可以满足要求 也可以采用碧云天的多功能电泳仪 带定时 为了 电泳方便起见 也可以采用整个 SDS PAGE 过程恒压的方式 通常把电压设 在 100V 然后设定定时时间为 90 120 分钟 设置定时可以避免经常发生的 电泳过头 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳 或者可以根 据预染蛋白质分子量标准的电泳情况 预计目的蛋白已经被适 当分离后即可停 止电泳 3 转膜 Transfer 我们推荐在 Western 实验中选用 PVDF 膜 硝酸纤维素膜 NC 膜 也可以使用 但硝酸纤维素膜比较脆 在操作过程中特别是用镊子 夹取等过程中容易裂开 膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤 通常如果使用 Bio Rad 的标准湿式转膜装置 可以设定转膜电流为 300 400mA 转膜时间为 30 60 分钟 也可以在 15 20mA 转膜过 夜 转膜时也可 以使用碧云天的多功能电泳仪 带定时 具体的转膜时间要根据目的蛋白的大 小而定 目的蛋白的分子量越大 需要的转膜时间越长 目的蛋白的分子量越 小 需要的转膜时间越短 在转膜过程中 特别是高电流快速转膜时 通常会有非常严重的发热现象 最 好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜 转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白 质分子量标准 通常分子量最大的 1 2 条带较难全部转到膜上 转膜的效果也 可以用丽春红染色液对膜进行染色 以观察实际的转膜效果 也可以用考马斯 亮蓝快速染色液对完成转膜的 SDS PAGE 胶进行染色 以观察蛋白的残留情 况 4 封闭 Blocking 转膜完毕后 立即把蛋白膜放置到预先准备好的 Western 洗涤液中 漂洗 1 2 分钟 以洗去膜上的转膜液 从转膜完毕后所有的步 骤 一定要注意膜的保湿 避免膜的干燥 否则极易产生较高的背景 用微型台式真空泵吸尽洗涤液 加入 Western 封闭液 在摇床上缓慢摇动 室温 封闭 60 分钟 对于一些背景较高的抗体 可以在 4 封闭过夜 在整个 Western 过程中我们推荐使用碧云天生产的侧摆摇床 侧向摆动速度比较缓慢 而且也容易让溶液覆盖蛋白膜 5 一抗孵育 Primary antibody incubation 参考一抗的说明书 按照适当比例用 Western 一抗稀释液稀释一抗 用微型台式真空泵吸尽封闭液 立即加入稀释好的一抗 室温或 4 在侧摆摇 床上缓慢摇动孵育一小时 如果一抗孵育一小时效果不佳 可以在 4 缓慢摇 动孵育过夜 回收一抗 加入 Western 洗涤液 在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤 5 10 分钟 吸 尽洗涤液后 再加入洗涤液 洗涤 5 10 分钟 共洗涤 3 次 如果结果背景较高 可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数 6 二抗孵育 Secondary antibody inucubation 参考二抗的说明书 按照适当比例用 Western 二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶 HRP 标记的二抗 用微型台式真空泵吸尽洗涤液 立即加入稀释好的二抗 室温或 4 在侧摆摇 床上缓慢摇动孵育一小时 回收二抗 加入 Western 洗涤液 在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤 5 10 分钟 吸 尽洗涤液后 再加入洗涤液 洗涤 5 10 分钟 共洗涤 3 次 如果结果背景较高 可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数 7 蛋白检测 Detection of proteins 参考相关说明书 使用 BeyoECL Western 荧光检测试剂等 ECL 类试剂来检测 蛋白 洗片时可以使用 X 光片自动洗片机 如果没有自动洗片机 可以用显影定影试 剂盒自行配制显影液和定影液进行手工洗片 8 膜的重复利用 Membrane recovery 如果蛋白样品非常宝贵 可以使用 Western 一抗二抗去除液处理蛋白膜 以重 复利用蛋白膜 五 五 实验常见的问题指南实验常见的问题指南 1 参考书推荐参考书推荐 2 针对样品的常见问题针对样品的常见问题 3 抗体抗体 4 滤纸 胶和膜的问题滤纸 胶和膜的问题 5 Marker 的相关疑问的相关疑问 6 染色的选择染色的选择 7 参照的疑问参照的疑问 8 缓冲液配方的常见问题缓冲液配方的常见问题 9 条件的摸索条件的摸索 10 方法的介绍方法的介绍 11 结果分析结果分析 一 一 原理原理 与与 Southern 或或 Northern 杂交方法类似 但杂交方法类似 但 Western Blot 采用的是聚丙烯酰采用的是聚丙烯酰 胺凝胶电泳 被检测物是蛋白质 胺凝胶电泳 被检测物是蛋白质 探针探针 是抗体 是抗体 显色显色 用标记的二抗用标记的二抗 经过 经过 PAGE 分离的蛋白质样品 转移到固相载体 例如硝酸纤维素薄膜 上 固相分离的蛋白质样品 转移到固相载体 例如硝酸纤维素薄膜 上 固相 载体以非共价键形式吸附蛋白质 且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活载体以非共价键形式吸附蛋白质 且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活 性不变 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原 与对应的抗体起免疫反应 性不变 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原 与对应的抗体起免疫反应 再与酶或同位素标记的第二抗体起反应 经过底物显色或放射自显影以检测电再与酶或同位素标记的第二抗体起反应 经过底物显色或放射自显影以检测电 泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分 该技术也广泛应用于检测蛋白水平泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分 该技术也广泛应用于检测蛋白水平 的表达 的表达 二 分类二 分类 现常用的有底物化学发光现常用的有底物化学发光 ECL 和底物和底物 DAB 呈色 体同水平和实验条件的是用呈色 体同水平和实验条件的是用 第一种方法 目前发表文章通常是用底物化学发光第一种方法 目前发表文章通常是用底物化学发光 ECL 只要买现成的试剂盒 只要买现成的试剂盒 就行 操作也比较简单 原理如下 二抗用就行 操作也比较简单 原理如下 二抗用 HRP 标记 反应底物为过氧化标记 反应底物为过氧化 物物 鲁米诺 如遇到鲁米诺 如遇到 HRP 即发光 可使胶片曝光 就可洗出条带 即发光 可使胶片曝光 就可洗出条带 三 主要试剂三 主要试剂 1 丙烯酰胺和丙烯酰胺和 N N 亚甲双丙烯酰胺 应以温热亚甲双丙烯酰胺 应以温热 以利于溶解双丙稀酰胺以利于溶解双丙稀酰胺 的的 去离子水配制含有去离子水配制含有 29 w v 丙稀酰胺和丙稀酰胺和 1 w v N N 亚甲双丙烯酰胺储存液亚甲双丙烯酰胺储存液 丙稀酰胺丙稀酰胺 29g N N 亚甲叉双丙稀酰胺亚甲叉双丙稀酰胺 1g 加 加 H2O 至至 100ml 储于棕色瓶 储于棕色瓶 4 避光保存 严格核实避光保存 严格核实 PH 不得超过不得超过 7 0 因可以发生脱氨基反应是光催化或 因可以发生脱氨基反应是光催化或 碱催化的 使用期不得超过两个月 隔几个月须重新配制 如有沉淀 可以过碱催化的 使用期不得超过两个月 隔几个月须重新配制 如有沉淀 可以过 滤 滤 2 十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠 SDS 溶液溶液 10 w v 0 1gSDS 1mlH2O 去离子水配制 去离子水配制 室温保存 室温保存 3 分离胶缓冲液分离胶缓冲液 1 5mmol LTris HCL pH8 8 18 15gTris 和和 48ml1mol LHCL 混合 加水稀释到混合 加水稀释到 100ml 终体积 过滤后终体积 过滤后 40C 保存 保存 4 浓缩胶缓冲液浓缩胶缓冲液 0 5mmol LTris HCL pH6 8 6 05gTris 溶于溶于 40mlH2O 中 中 用约用约 48ml 1mol L HCL 调至调至 pH6 8 加水稀释到加水稀释到 100ml 终体积 过滤后终体积 过滤后 40C 保保 存 这两种缓冲液必须使用存 这两种缓冲液必须使用 Tris 碱制备 再用碱制备 再用 HCL 调节调节 PH 值 而不用值 而不用 Tris CL 5 TEMED 原溶液原溶液 N N N N 四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速 两种丙稀酰胺的聚合 两种丙稀酰胺的聚合 PH 太低时 聚合反应受到抑制 太低时 聚合反应受到抑制 10 w v 过硫酸胺溶过硫酸胺溶 液 提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基 去离子水配制数液 提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基 去离子水配制数 ml 临用前配制 临用前配制 6 SDS PAGE 加样缓冲液加样缓冲液 pH6 8 0 5mol L Tris 缓冲液缓冲液 8ml 甘油 甘油 6 4ml 10 SDS 12 8ml 巯基乙醇 巯基乙醇 3 2ml 0 05 溴酚蓝溴酚蓝 1 6ml H2O 32ml 混匀备用 按混匀备用 按 1 1 或或 1 2 比例与蛋白质样品混合 在沸水终煮比例与蛋白质样品混合 在沸水终煮 3min 混匀后再混匀后再 上样 一般为上样 一般为 20 25ul 总蛋白量 总蛋白量 100 g 7 Tris 甘氨酸电泳缓冲液甘氨酸电泳缓冲液 30 3gTris 188g 甘氨酸 甘氨酸 10gSDS 用蒸馏水溶 用蒸馏水溶 解至解至 1000ml 得 得 0 25mol L Tris 1 92mol L 甘氨酸电极缓冲液 临用前稀释甘氨酸电极缓冲液 临用前稀释 10 倍 倍 8 转移缓冲液 配制转移缓冲液 配制 1L 转移缓冲液 需称取转移缓冲液 需称取 2 9g 甘氨酸 甘氨酸 5 8gTris 碱 碱 0 37g SDS 并加入 并加入 200ml 甲醇 加水至总量甲醇 加水至总量 1L 9 丽春红染液储存液 丽春红丽春红染液储存液 丽春红 S 2g 三氯乙酸三氯乙酸 30g 磺基水杨酸磺基水杨酸 30g 加水至加水至 100ml 用时上述储存液稀释用时上述储存液稀释 10 倍即成丽春红倍即成丽春红 S 使用液 使用后应予以废弃 使用液 使用后应予以废弃 10 脱脂奶粉脱脂奶粉 5 w v 11 NaN3 0 02 迭氮钠迭氮钠 有毒 戴手套操作有毒 戴手套操作 溶于磷酸缓冲盐溶液 溶于磷酸缓冲盐溶液 PBS 12 Tris 缓冲盐溶液缓冲盐溶液 TBS 20mmol LTris HCL pH7 5 500mmol LnaCl 13 Tween20 15 鼠抗人鼠抗人 MMP 9 16 鼠抗人鼠抗人 TIMP 1 14 过氧化物酶标记的第二抗体 过氧化物酶标记的第二抗体 15 NBT 溶于溶于 70 二甲基甲酰胺 二甲基甲酰胺