08无菌检查法

第 1 页 共 4 页 CBS03 J7 A08 目的目的 建立无菌检验标准操作规程 保证检验人员操作规范化 标准化 确保企业产 品质量 范围范围 本标准规定了无菌检验方法 责任责任 质量控制部化验员 内容内容 1 标准依据 中华人民共和国药典 2000 年版 第二部 2 说明 无菌检查法系指检查药品是否无菌的一种方法 3 实验准备 3 1 试剂与溶液 75 乙醇 无菌 0 9 氯化钠溶液 新洁尔灭 1 1000 溶液 3 5 甲酚溶液或 适宜的消毒溶液 3 2 仪器与用具 电热干燥箱 恒温培养箱 刻度吸管 试管 净化工作台 3 3 培养基与菌种 3 3 1 硫乙醇酸盐流体培养基 真菌琼脂培养基 真菌培养基 3 3 2 藤黄微球菌 CMCC B 28 001 生孢梭菌 CMCC B 64 941 白色 念珠菌 CMCC F 98 001 金黄色葡萄球菌 CMCC B 26003 4 操作方法 4 1 无菌室的无菌程度检查 文件名称无菌检验标准操作规程无菌检验标准操作规程 文件编号CBS03 J7 A08 起 草 人起 草 日 期年 月 日 审 核 人审 核 日 期年 月 日 批 准 日 期年 月 日 批 准 人 执 行 日 期年 月 日 颁发部门质量控制部印 数3 分发部门 总 办 质 保 质 控 生 技 提 取 固 体 物 料 设 备 供 销 办 公 针 剂 安 全 工 会 财 务 后 勤 分发数量 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 第 2 页 共 4 页 CBS03 J7 A08 4 1 1 无菌室在消毒处理后 无菌试验前及操作过程中需检查空气中菌落数 取直径约 90mm 双碟 在接种室内点燃酒精灯 在酒精灯旁 以无菌操作 将双碟半开注入溶化的营养琼脂培养基约 20ml 制成平板 在 30 35 预培养 48 小 时 证明无菌后将平板 3 个 以无菌方式带入无菌操作室内的洁净区左 中 右各 放 1 个 打开碟盖扣置 平板在空气中暴露 30 分钟后将碟盖盖好 置 30 35 培养 48 小时 取出检查 100 级清洁度要求 3 个平板上生长的菌落数平均不得超过 1 个 4 4 2 仪器准备 实验所用的玻璃器皿 试管 量筒 三角瓶 移液管 刻度吸管 1 5 10ml 注射器 2 5 10 双碟等 用清洁液浸泡 水洗 3 次 晾干后 用牛皮纸包扎严 密 置于电热干燥箱中 160 干热灭菌 2 小时或 140 干热灭菌 4 小时 4 4 3 培养基灵敏度检查 4 4 3 1 菌种 4 4 3 1 1 藤黄微球菌 CMCC B 28 001 4 4 3 1 2 生孢梭菌 CMCC B 64 941 4 4 3 1 3 白色念珠菌 CMCC F 98 001 4 4 3 2 操作 4 4 3 2 1 需气菌 厌气菌培养基用藤黄微球菌和生孢梭菌两种菌检查 取藤黄微球菌的营养琼脂斜面新鲜培养物 加无菌 0 9 氯化钠溶液 3ml 制成 均匀的菌悬液 再以无菌 0 9 氯化钠溶液稀释至与细菌浊度标准管相同的浓度 然 后作 10 倍系列稀释 制成 1ml 中含 10 100 个菌 CFU 并计数 取生孢梭菌的需气菌 厌气菌培养基的新鲜培养物 用灭菌毛细管将其吸至灭 菌离心管内 离心 弃去上清液 取沉淀菌体用无菌 0 9 氯化钠溶液制成均匀菌悬 液 吸取上述菌悬液 用无菌 0 9 氯化钠溶液稀释 照上述方法制成 1ml 含 10 100 个菌并计数 4 2 3 2 2 真菌培养基用白色念珠菌检查 取白色念珠菌的真菌琼脂斜面新鲜培养物 加无菌 0 9 氯化钠溶液 3ml 制成 均匀的菌悬液 照藤黄微球菌项下方法稀释制成 1ml 中含 10 100 个菌并计数 4 2 3 2 3 取藤黄微球菌的营养肉汤 生孢梭菌的需气菌厌气菌培养基的新鲜培 养物 白色念珠菌的真菌培养基的新鲜培养物各 1ml 用无菌 0 9 氯化钠溶液作 10 倍系列稀释 制成 1ml 中含 10 100 个菌并计数 4 2 3 2 4 将藤黄微球菌的上述之一的稀释液各 1ml 分别接种至每管装量为 9ml 的需气菌 厌气菌培养基 3 管 生孢梭菌的上述之一的稀释液各 1ml 分别接 种至每管装量为 12ml 的需气菌 厌气菌培养基 3 管 由白色念珠菌的上述之一的稀 第 3 页 共 4 页 CBS03 J7 A08 释液各 1ml 接种至每管装量为 9ml 的真菌培养基 3 管 以未接种的培养基作对照 按规定的温度培养 5 天 并逐日记录结果 4 4 3 3 结果判定 以每株菌接种后的培养基不得少于 2 管呈现生长 即该培养基的灵敏度检查符 合要求 4 4 4 对照用菌液的制备 4 4 4 1 金黄色葡萄球菌菌液 用接种环取金黄色葡萄球菌的营养琼脂斜面新 鲜培养物少许 接种至需气菌 厌气菌培养基内 在 30 35 培养 16 18 小时 用无 菌 0 9 氯化钠溶液稀释制成每 1ml 中含 10 100 个菌 4 4 4 2 生孢梭菌菌液 用接种环取生孢梭菌的需气菌 厌气菌培养基新鲜培 养物少许 接种至相同的培养基内 在 30 35 培养 18 24 小时 用无菌 0 9 氯化 钠溶液稀释制成每 1ml 中含 10 100 个菌 4 4 4 3 白色念珠菌菌液 用接种环取白色念菌的真菌琼脂培养基斜面培养物 少许 接种至真菌培养基内 在 20 25 培养 24 小时 用无菌 0 9 氯化钠溶液稀释 制成每 1ml 中含 10 100 个菌 4 4 4 4 上述制备的菌液 一般当日使用 4 4 5 抑细菌和抑真菌试验 取每管装量为 9ml 的需气菌 厌气菌培养基 4 管及真菌培养基 2 管 分别接种 金黄色葡萄球菌 生孢梭菌 白色念珠菌 10 100 个菌各两管 其中 1 管加供试品规 定量 按规定的温度培养 3 5 日 如培养基各管 24 小时内微生物生长良好 则供试 品无抑菌作用 如加供试品的培养基管与未加供试品的培养基管对照比较 微生物 生长微弱 缓慢或不生长 均判断为供试品有抑菌作用于 该供试品需用稀释法或 中和法 薄膜过滤法处理 消除供试品的抑菌性后 方可接种至培养基 4 4 6 直接接种法 4 4 6 1 供试品制备 用灭菌镊取出注射器 在火焰旁将针芯插入针管并安上针头 供试品瓶盖和注 射器针头均应迅速通过火焰数次 以无菌操作吸取供试品一定量 接种于上述培养 基中 4 4 6 2 操作 用注射器吸取供试品 沿培养基管壁分别接种于需气菌 厌气菌培养基 6 管 其中 1 管于操作结束后移至接种室接种金黄色葡萄球菌对照菌液 1ml 真菌培养 基 5 管 轻轻摇动使匀 需气菌 厌气菌培养基在 30 35 培养 真菌培养基在 20 25 培养 7 日 培养期间应逐日检查是否有菌生长 阳性对照在 24 小时内应有菌生 长 并填写检查记录表 如在加入供试品后 培养基出现浑浊 培养 7 日后 不能 第 4 页 共 4 页 CBS03 J7 A08 从外观上判断无微生物生长 可取该培养液适量接种于同种新鲜培养基中或斜面上 继续培养 细菌培养 2 日 真菌培养 3 日 观察是否再现浑浊或斜面上有无菌落生 长 在接种的同时 取培养液少量 涂片制成染色标本 用显微镜观察是否有菌生 长 4 4 7 结果判断 当阳性对照管显浑浊并确有细菌生长时 可根据观察所得的结果判定 如需气菌 厌气菌及霉菌