T4 DNA 连接酶 #EL0011 Thermo scientific

T4 DNA Ligase Thermo scientific EL0011 产品信息产品信息 特点特点 快速 室温下10分钟内完成粘末端的连接反应 该酶在 Fermentas 公司限制酶 PCR 和 RT 缓冲液 添加 ATP 中活性 配套提供聚乙二醇溶液以有效进行平末端连接 应用应用 克隆酶切产生的 DNA 片段 克隆 PCR 产物 连接双链寡聚核苷酸街头或连接物 定点诱变 扩增片段长度多态性 AFLP 连接酶介导的 RNA 检测 3 双链 DNA RNA 或 DNA RNA 复合体中缺口的修复 线性 DNA 自身环化 说明说明 T4 DNA Ligase 催化双链 DNA 或 RNA 中毗邻的5 磷酸基团和3 羟基末端之间形成 磷酸二酯键 酶还可以修复双链 DNA RNA 或 DNA RNA 复合体中的单链切口 连接 DNA 的粘性和平末端 但是该酶对单链核酸无酶活性 1 2 T4 DNA Ligase 需要辅因子 ATP 浓度浓度 1 Weiss u l 200 CEU l 5 Weiss u l 1000 CEU l 30 Weiss u l 6000 CEU l 一个粘性末端连接单位的是指在16 C 30分钟内50 连接 HindIII 酶切的 lamda DNA 产物所需要的酶的量 来源来源 含有 T4噬菌体克隆基因30的大肠杆菌 分子量分子量 55 3 kDa 单体 活性单位定义活性单位定义 1个活性单位是指在 ATP PPi 交换反应中 37 C 20分钟内将1nmol 32PPi 转换为 Norit 可吸收形式所需的酶量 Weiss 单位 4 酶活性分析混合物 66 mM Tris HCl pH 7 6 6 6 mM MgCl2 0 066 mM ATP 10 mM DTT 3 3 M 32PPi 1个 Weiss 单位相当于约200个粘性末端连接单位 1个粘性末端连接单位 20 l 反应体系 50 mM Tris HCl pH 7 5 10 mM 燤 gCl2 10 mM 燚 TT 1 mM ATP 25 g ml 燘 SA 0 12 M 300 g ml 的5 DNA 末 端 中 在16 C 30分钟内50 连 接 HindIII 酶切的 Lambda DNA 产物所需要的酶量 保存缓冲液保存缓冲液 保存缓冲液组分 20 mM Tris HCl pH 7 5 1 mM DTT 50 mM KCl 0 1 mM EDTA 和50 v v 甘 油 10X T4 DNA Ligase 缓冲液缓冲液 B69 400 mM Tris HCl 100 mM MgCl2 100 mM DTT 5 mM ATP pH 7 8 25 C 质量控制质量控制 相关测试表明无内切和外切脱氧核糖核酸酶 核糖核酸酶 磷酸酶污染 功能检测 粘性 末端或平末端 DNA 的连接能力 抑制与失活抑制与失活 抑制剂 当反应体系中 NaCl 或 KCl 的浓度超过200 mM 时 可强烈抑制 T4 DNA Ligase 活性 失活 65 C 加热10分钟或者70 C 加热5分钟 备注备注 聚乙二醇 PEG 极大地增加平末端连接效率 5 反应体系中的 PEG 4000的建 议浓度为5 w v T4 DNA Ligase 与 DNA 结合会改变条带的琼脂糖凝胶电泳迁移率 为避免此现 象 电泳前需处理样本或分子量标准 样本处理方法如下 样本或分子量标准与 Fermentas 公司6X DNA Loading Dye SDS 溶液 R1151 混合 70 C 加热5 分钟或65 C 加热10分钟后冰浴保存 转化时 连接产物的体积不能超过感受态细胞体积的10 电转化之前 先用氯仿抽提方法除去连接混合物中的 T4 DNA Ligase 然后经乙 醇沉淀纯化抽提产物 操作手册操作手册 DNA 插入片段与载体插入片段与载体 DNA 连接连接 1 反应体系配方如下 组分粘性末端连接平末端连接 线性载体 DNA20 100 ng 插入片段 DNA与载体的摩尔比为1 1到5 1 10X T4 DNA Ligase buffer2 l 50 PEG 4000 溶液 2 l T4 DNA Ligase0 2 l 1 u 1 l 5 u 水 无核酸酶 R0581 至 20 l 总体积20 l20 l 50 PEG 4000溶液随 Fermentas T4 DNA Ligase 配套提供 EL0335 EL0334 2 粘性末端 22 C 孵育10分钟 平末端 22 C 孵育1小时 3 65 C 热失活10分钟 4 转化 每50 l 化学感受态细胞使用5 l 连接产物 每50 l 电转感受态细胞使用1 2 l 连接产物 备注备注 如需增加转化子数量 如果连接产物的产量不够 建议4 C 孵育连接过夜 采用氯仿抽提替换热失活方法 平末端连接产物建议采用电转化方法 线性线性 DNA 自身环化自身环化 1 反应体系配方如下 线性载体 DNA10 50 ng 10X T4 DNA Ligase buffer5 l T4 DNA Ligase1 l 5 u 水 无核酸酶 R0581 至 50 l 总体积50 l 2 充分混匀后短暂离心 22 C 孵育1小时 3 65 C 热失活10分钟 4 取大约5 l 连接产物转化50 l 化学感受态细胞 备注备注 采用氯仿抽提替换热失活方法 平末端连接产物建议采用电转化方法 接头连接接头连接 双链寡核苷酸接头常用于产生插入片段中没有的兼容性突出末端 接头含有限制酶识别位点 与目标片段 连接后酶切可产生与克隆载体匹配的粘性末端 此外接头也可直接带有匹配的粘性末端 与克隆载体直接 连接 无需额外操作 1 根据应用不同 准备下列的反应体系 组分连接 用于后续酶切仅仅连接 线性 DNA5 l 100 500 ng 磷酸化接头5 l 1 2 g 10X T4 DNA Ligase buffer 2 l 限制酶用10X buffer2 l ATP 10 mM 1 l 终浓度0 5 mM 50 PEG 4000 溶液 2 l T4 DNA Ligase EL0334 或 EL0335 0 4 l 或 2 l 2 u 水 无核酸酶 R0581 至 20 l 总体积至 20 l至 20 l 混合10 l 100 mM ATP 溶液 R0441 和90 l 水 无核酸酶 R0581 制备10 mM ATP 溶液 50 PEG 4000溶液随 Fermentas T4 DNA Ligase 配套提供 EL0335 EL0334 2 充分混匀后短暂离心 22 C 孵育1小时 3 65 C 热失活10分钟 备注备注 连接产物酶切前无需纯化 可将限制酶直接加入连接反应混合物中 T4 DNA Ligase 活性分析对照反应活性分析对照反应 连接酶失活或样本 DNA 中的杂质会导致连接失败 推荐采用对照 DNA 如 Lambda DNA HindIII DNA Marker SM0101 的连接实验分析 T4 DNA ligase 的活性 1 对照连接混合物准备 Lambda DNA HindIII DNA Marker SM0101 1 l 0 5 g 10X T4 DNA Ligase Buffer2 l T4 DNA Ligase1 u 水 无核酸酶水 无核酸酶 R0581 至 20 l 总体积总体积至至 20 l 2 充分混匀后短暂离心 22 C 孵育10分钟 3 制备上样混合物 连接产物连接产物10 l 6X DNA Loading Dye SDS Solution 2 l 图图 1 对照实验评价 T4 DNA Ligase 活性 1 Lambda DNA HindIII fragments 未连接 2 连接后的 Lambda DNA HindIII 结果解释结果解释 出现更高分子量条带且低分子量条带变弱 表明连接酶有活性 连接后条带不发生变化 说明连接酶失活 参考文献 Rossi R et al Functional characterization of the T4 DNA Ligase a new insight into the mechanism of action Nucleic Acids Res 25 2106 2113 1997 Cherepanov A V et al Binding of nucleotides by T4 DNA Ligase and T4 RNA Ligase optical absorbance and fluorescence studies Biophys J 81 3545 3559 2001 Nilsson M et al RNA templated DNA ligation for transcript analysis Nucleic Acids Res 29 578 581 2001 Weiss B et al Enzymatic breakage and joining of deoxyribonucleic acid J Biol Chem 243 4543 4555 1968 Pheif