纤维素酶的生产及分离纯化

纤维素酶 纤维素酶编号 EC 3 2 1 4 它是酶的一种 在分解纤维素时起生物催化 作用 是可以将纤维素分解成多糖或单糖的蛋白质或 纤维素酶广泛存 在于自然界的生物体中 细菌 真菌 动物体内等都能产生纤维素酶 一般用 于生产的纤维素酶来自于真菌 比较典型的有木酶属 曲霉属和青霉属 纤维素酶是一种重要的酶产品 是一种复合酶 主要由外切 葡聚糖酶 内切 葡聚糖酶和 葡萄糖苷酶等组成 还有很高活力的木聚糖酶活力 由 于纤维素酶在饲料 酒精 纺织和食品等领域具有巨大的市场潜力 已被国内 外业内人士看好 将是继糖化酶 淀粉酶和蛋白酶之后的第四大工业酶种 甚 至在中国完全有可能成为第一大酶种 因此纤维素酶是酶制剂工业中的一个新 的增长点 纤维素酶的生产方法 固体发酵法 固体发酵法以玉米 稻草等植物秸秆为主要原料生产纤维素酶 该法投资 少 工艺简单 产品价格低廉 然而固体发酵法存在着根本上的缺陷 不可 能像液体发酵那样随着规模的扩大 大幅度降低成本 以秸秆为原料的固体发 酵法生产的纤维素酶很难提取和精制 目前生产厂家只能采用直接干燥 粉碎 来得到固体酶制剂 或用水浸泡后压滤得到液体酶制剂 产品外观粗糙 质量 不稳定 杂质含量高 劳动强度大 生产效率低 易污染杂菌 国内外对木霉 纤维素酶的研究较多 但木霉一方面毒性嫌疑大 使之应用受到限制 另一方 面普遍存在着 葡萄糖昔酶活力偏低的缺陷 致使纤维二糖积累 影响了酶 解效率 液体发酵法 液体发酵生产时 将原料送入发酵罐内发酵 同时接入纤维素酶菌种 发 酵过程中 需要从发酵罐底部通入无菌空气对物料进行气流搅拌 发酵完后的 物料经过处理可得到纤维素酶产品 液体发酵法生产纤维素酶 原料利用率高 生产条件易控制 产量高 劳动强度小 产品质量稳定 但动力消耗大 设备 要求高 液体深层发酵的方法具有培养条件容易控制 不易染菌 生产效率高 等特点 因此 目前此方法是大规模生产的可行方法 其生产工艺过程是将玉米秸秆粉碎至 20 目以下 进行灭菌处理后 送发酵 釜内发酵 同时加入纤维素酶菌种 发酵时间约为 70 h 控制温度低于 60 将净化后的无菌空气从釜底通入 进行物料的气流搅拌 发酵完的物料经压滤 机压滤 超滤浓缩 喷雾干燥 制得纤维素酶产品 其流程为 空气 过滤 原料 发酵罐 浸泡 粗滤 超滤提取 成品 种子 摇瓶 床 纤维素酶的分离纯化 纤维素酶的组分大多为糖蛋白 工业上用于生产纤维素酶的粗酶制剂常采 用硫酸铵沉淀法 酒精沉淀法 丹宁沉淀法和离心喷雾干燥等方法 但在纤维 素酶分析研究上主要采用一系列蛋白质分离纯化技术 如分级沉淀 色谱法 电泳法等 目前 对粗酶的提取大多采用硫酸桉分级沉淀法 对酶活力的测定 国际上一般采用 Horikoshi 方法 对蛋白质的测定按考马斯亮蓝 Bradford 法 还原糖的测定采用 一二硝基水杨酸 DNS 法 以下介绍一些常用的纯化方 法 1 盐析法 盐析法就是在溶液中加入中性盐使各种蛋白质依次分别沉淀 的方法 其原理是根据蛋白质在溶液中由于表面带电的氨基酸残基与溶剂分子 H20 相互作用 所以能保持溶解状态 当加入盐离子时 蛋白质分子周围所带 电荷增加 促进了与溶剂分子的相互作用 使溶解度增加 此现象称为盐溶 在盐浓度较低时以这种情形为主 但当盐浓度继续增加达到一限量 大量盐离 子使水浓度相对降低 蛋白质的水化作用减弱 相互凝聚而沉淀下来 称为盐 析 选择一定浓度范围的盐 如 0 25 饱和度硫酸铵 使杂质蛋白沉淀而有效 成分呈盐溶状态 经离心分离得到上清液后 再选择一定浓度范围的盐溶液使 有效成分等物质呈盐析状态而另一部分杂质呈盐溶状态 用离心法收集的沉淀 物即为初步纯化的有效成分物质 此法是蛋白质进行分级沉淀时常用操作步骤 常选用的盐是硫酸铵 2 凝胶过滤 凝胶过滤又叫分子筛层析 是利用分子筛效应分离纯化生 物大分子和测定其分子量及样品脱盐的一种色谱方法 凝胶过滤层析所用的基 质是具有立体网状结构 筛孔直径一致的球状颗粒 这种物质可以完全或部分 排阻某些大分子物质 而不能排阻某些小分子化合物 当样品进入色谱柱时 由于被分离物质的分子质量不同 较大的分予不能通过孔道进入凝胶颗粒的微 孔内部 与流动相一起先流出色谱柱 分子质量小的物质可通过部分孔道 更 小的分子可通过任意孔道进入珠体内部 这样小分子向下流动的速度必然比大 分子慢 结果是分子质量大的物质先从柱中流出 分子质量小的则后从柱中流 出而达到分离的目的 凝胶过滤具有设备简单 操作方便 重复性好及样品回 收率高等特点 所以该方法除了常用于分离纯化蛋白质 核酸 多糖 激素 氨基酸和抗生素等物质外 还可测定蛋白质的分子量 样品浓缩和脱盐等方面 3 亲和层析 亲和层析的原理与抗原一抗体 酶一底物等特异性反应的 机理相类似 每对反应物之间都有一定的亲和力 在亲和层析中是特异的配体 才能和一定的生命大分子之间具有亲和力 将具有识别能力的载体 L 以共价键 的方式固化到含有活性基团的基质 M 上 制成亲和吸附剂 M L 又称为固相载 体 当把固相载体装入小层析柱后 将欲分离的样品液通过该柱 此时样品中 对配体有亲和力的物质 S 可借静电引力 范德华力等作用吸附到固相载体上 无亲和力的 物质被起始缓冲液洗涤出来 形成了第一个层析峰 然后适当地改变起始缓冲 液的 pH 或增加离子强度等方法 把物质 S 从固相载体上解离下来 并形成第二 个层析峰 可以将有效成分与杂质较好地分离开来 使用亲和层析法 不论加 入何种样品液 由于柱体积小 上样量大 洗脱流速快等原因 都只能得到一 个层析峰 所以分辨率高 本法广泛应用于分离纯化蛋白质 核酸 激素等物 质 4 离子交换层析 离子交换层析是根据物质所带电荷的差别进行分离纯化 的方法 离子交换剂以纤维素 葡聚糖凝胶等不溶性物质为母体 通过酯化 醚化或氧化等化学反应 引入阳性或阴性离子的特殊制剂 可与带相反电荷的 化学物质进行交换吸附 对于呈两性离子的蛋白质 酶类 多肽等物质与离子 交换剂的结合力 取决于它们的物理化学性质和特定 pH 条件下呈现的离子状态 当 pH 低于等电点 pI 时 被阳离子交换剂吸附 反之被阴离子交换剂吸附 对 于呈胶体状态的大分子物质一般使用选择性好的弱酸性离子交换剂 离子交换 层析法是常用的层析方法之一 广泛应用于多种生化物质的分析 制备 纯化 等 5 高效液相色谱 HPLC 又称为高速或高压液相色谱 其分离或纯化各种 化合物的原理基本上与普通的液相层析相似 但高效液相色谱具有灵敏 快速 分辨率高及重复性好等特点 不仅适用于很多不易挥发 难热分解物质 如蛋白 质 氨基酸及其衍生物 核酸 激素 单糖 寡糖等 的定性和定量分析 而且 也适用于上述物质的制备和分离 特别是近十年来出现了几种与 HPLC 相近的快 速蛋白液相色谱 FPLC 低压液相色谱 LPLC 和中压液相色谱 MPLC 其中 FPLC 能在惰性环境下 以极快的速度通过成百上千次层析把复杂的混合物分开 如果连续进样 短时间内能制备出大量的欲纯化物质 6 电泳 电泳是带电颗粒在电场作用下 向着与其电荷相反的电极移动的 现象 当把一个带净电荷的颗粒放入电场时 就会受到电场力的作用 带电颗 粒在电场中向一定方向泳动 速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比 与颗粒半径和黏度成反比 当颗粒是两性电介质性质的蛋白质分子时 它在一 定 pH 溶液中电荷量是独特的 由于不同的蛋白质等电点和分子量是不同的 因 此经泳动后就形成了泳动度不同的区带 利用此性质 可以将混合液中不同的 蛋白质区分开 同时也可以对其纯度进行测定 现在电泳法已成为开展生物化 学和分子生物学研究的必不可少的常规工具 随着人们对纤维素酶研究工作的深入 纤维素酶必将在食品 饲料 环境 保护 能源和资源开发等各个领域中发挥越来越大的作用 如何加大对纤维素 酶研究和开发的