CCK8实验原理与步骤

CCK8 实验实验 1 在 96 孔板中配置 100 l 的细胞悬液 将培养板在培养箱预培养 24 小时 37 5 CO2 2 向培养板加入 10 l 不同浓度的待测物质待测物质 3 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间 例如 6 12 24 或 48 小时 4 向每孔加入 10 l CCK8 溶液溶液 注意不要在孔中生成气泡 它们 会影响 OD 值的读数 5 将培养板在培养箱内孵育 1 4 小时 6 用酶标仪测定在 450nm 处的吸光度 7 若暂时不测定 OD 值 可以向每孔中加入 10 l 0 1M 的 HCL 溶液或者 1 w v SDS 溶液 并遮盖培养板避光保存在室温条件下 24 小时内测定 吸光度不会发生变化 PS 1 w v SDS 溶液配制方法 组份浓度 10 W V SDS 配制量 100ml 配制方法 1 称量 10g 高纯度的 SDS 置于 100 200ml 烧杯中 加入约 80ml 的去 离子水 68 加入溶解 2 滴加浓盐酸调节 pH 值至 7 2 3 将溶液定容至 100ml 后 室温保存 注意 如果待测物质待测物质有氧化性或还原性的话 可在加 CCK8 之前更 换新鲜培养基 除去培养基 并用培养基洗涤细胞两次 然后加入 新的培养基 去掉药物影响 当然药物影响比较小的情况下 可以 不更换培养基 直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可 活力计算 细胞活力细胞活力 A 加药 A 空白 A 0 加药 A 空白 100 A 加药 具有细胞 CCK8 溶液和药物溶液的孔的吸光度 A 空白 具有培养基和 CCK8 溶液而没有细胞的孔的吸光度 A 0 加药 具有细胞 CCK8 溶液而没有药物溶液的孔的吸光度 细胞活力 细胞增殖活力或细胞毒性活力 CCK 8 可以用于细胞增殖细胞增殖和毒性分析毒性分析 其基本原理为 该试剂中含 有 WST 8 它在电子载体 1 Methoxy PMS 的作用下被细胞线粒体中 的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒染料 生成的甲瓒物的 数量与活细胞的数量成正比 因此可以用这一特性直接进行细胞增殖 和毒性分析 其使用方法在增殖和毒性试验中有所区别 细胞增殖试验细胞增殖试验 1 接种细胞悬液 100 微升于 96 孔板 预先置于 37 度 5 CO2 饱和湿 度的培养箱内培养 2 在每孔内加入 10 微升的 CCK 8 试剂 3 把培养板放培养箱内 1 4 小时 根据细胞类型其时间有所不同 4 在 450nm 波长处测定吸光值 参比波长为 600nm 或以上波长 毒性分析试验毒性分析试验 1 接种 100 微升细胞悬液 5000 个 孔 于 96 孔板 2 预先放置 37 度 5 CO2 饱和湿度培养箱培养 24 小时 3 加入 10 微升不同浓度的毒性物质到孔内培养基 4 在培养箱内培养 48 小时 5 在每孔内加入 10 微升 CCK 8 试剂 在培养箱内培养 1 4 小时 6 在 450nm 波长处测定吸光值 参比波长为 600nm 或以上 以上步骤摘自 CCK 8 的说明书 由于涉及到某些原因 我省去了上面 的一些推销用语 内有标价 1245 元 1000 孔 写在前面 一直都像个新手 从未老道过 所有新手的迷茫与无奈我最能体会 看到园子里有一些同学在问有关 CCK8 试验的事情 当初我也和他 们一样 像个被蜘蛛丝缠住头的迷茫苍蝇一头扎进园子里 期待能 找到些解决谜团的只言片语 希望我写的这些非专业文字能够帮助 那些在实验室里没有前行者指点迷津的筒子们 当然仁者见仁智者 见智 我写的只是个人实验心得 仅供参考 欢迎大家拍砖共同进 步 实验是简单的 道路是曲折的 时间就是用来浪费的 科研就 是自娱自乐使劲折腾 我没有做过 MTT 实验 但其实原理及目的都是一样的 反应机理不 一样 都说 CCK8 简单点而且数据更稳定 所以就用了这个试剂盒 CCK8 的说明书大家一定要认真阅读 里面很多细节的问题都有提 到 而且说明书里提供的一些关于各种细胞的种板数都很有参考价 值 因为那是反复验证过的最佳数值 但无论如何 做这个试验一 定要摸条件 你就算再懒 这个懒不得 否则你都只是在做无用功 以下言论全部以细胞毒性试验为前提 如果你做的是促进细胞生长 的药物的药效实验那就另当别论了 摸条件包括 1 种板数 2 种板后细胞的贴壁生长时间 3 加药 后的孵育时间 4 CCK8 试剂加入量 5 CCK8 试剂加入后细胞孵 育时间 看起来很多 其实这就是一个实验 而且都是种的空白板 也就是不加药物 只加细胞和 CCK8 1 种板数 这个要查文献 看你所用细胞别人有无做过 把范围大 致找出 记住还要参考说明书 这个很重要 然后稀释一系列浓度 种板 首先你要观察多长时间细胞可贴壁完全 一般贴壁生长 24 小 时 然后还有在你的实验时间内 不同细胞数下孔内生长情况 比 如我拟定考察 4 天的时间 那么在 4 天内 细胞是刚好铺满还是堆 积生长 因为每块板都会设置对照孔 也就是含有细胞的培养基 CCK8 这个数值是板上的最大数值 CCK8 试验最佳 OD 值在 1 0 附近 所以这个最大数值最好能控制在 1 0 左右 我的实验经验是 不要让细胞长满 一旦长满了很难去判断是否堆积生长了 对药物 能否顺利进入细胞有影响此为其一 其二生长不均匀易导致孔间 OD 值数据偏差大 而且 OD 值也很大 2 贴壁生长的时间我一般就直接让它贴壁长 24h 了 这个时间细胞 已经贴壁完全 而且这样设置时间对自己安排实验时间也方便 没 人愿意大半夜爬起来做实验吧 3 加药后的孵育时间 我的实验摸了 3 个时间 24h 48h 72h 然后根据数据的稳定性 RSD OD 值的范围 1 0 左右 这些来选 择最好的时间 太长了就没有必要了 细胞呆在孔里几天不换液结 果可想而知了 4 CCK8 试剂加入量 说明书中明确写出建议加入量为培养基体积 的 10 这里有一个问题 假设我要孔内是 200 微升的体系 即细 胞悬液 药液 CCK8 200 微升呢 还是细胞悬液 药液 200 微升 CCK8 不算在体系内呢 关于这一点文献报道不一致 本人最终采 用的是后者 5 cck8 试剂加入后孵育时间 随着时间的增加 OD 值就会增大 总之原则就是把 OD 值控制在 1 0 左右 这里我考察了 0 5h 1 0h 2 0h 再说一下关于种板设置问题 众所周知周围一圈孔因为边缘效应都 是不用来做实验的 一般每组样品我会设置 6 个复孔 得到的 OD 值去掉最大值与最小值 其余取平均值 我用的是排枪 会省很多 力气 但是也会增大组内误差 这个只有通过校正移液枪和选用最 适枪头了 做这个实验我想大家遇到的最大问题应该是数据不稳定 组内数据 偏差大 讲了很多怎样摸条件 其实就一个原则 把 OD 值控制在 1 0 左右 数据不稳定也只能通过增大样品数 借助数据处理来弥补 还有实验操作一定要仔细小心 尽量平行操作 能力有限 表达不清的大家凑合着看看吧 有疑问的欢迎大家留言 讨论 我们的目标是共同进步 哈哈 补充 谢谢大家的热烈讨论 突然想起用酶标仪检测的时候还有一 些细节问题 园子里也有前辈提过 比如孔里不能有气泡 如果有 气泡 就用吸耳球吹掉 气泡会很影响检测结果 样品板要擦拭干 净 当然了 盖子一定要记得拿掉啊 补充说明 这几天有同学提出了一个问题 这个问题非常好也非常 关键 将 OD 值控制在 1 0 这个说法是否有依据 这里我还是想提醒大家一定要认真阅读试剂盒的说明书 试想一个 试剂盒的上市并且作为技术手段得到认可需要经过多少试验反复验 证 我购买的是同仁化学研究所的 CCK8 试剂盒 说明书的 P7Q23 OD 值在什么范围比较合适 答 一般情况下 OD 值在 0 1 2 0 都可以 在 1 0 附近比较好 再说到自己的实验设计 酶标仪的原理其实和紫外分光光度计是一 样的 所以 UV 上很多减小误差的注意事项在酶标仪上同样受用 这就能够理解为什么不能