荧光定量PCR的原理及使用

荧光定量荧光定量 PCR 的原理及使用的原理及使用 荧光定量 PCR FQ PCR 是新近出现的一种定量 PCR 检测方法 其基本特 点是 1 用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量 2 荧光信号通过荧光 染料嵌入双链 DNA 或双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等 方法获得 大大提高了检测的灵敏度 特异性和精确性 3 动态实时连续荧光 检测 免除了标本和产物的污染 且无复杂的产物后续处理过程 高效 快速 下面介绍常用的几种检测方法 1 双链 DNA 内插染料 某些染料如 SYBR Green 能选择性地与双链 DNA 结合 同时产生强烈荧光 在 PCR 过程中 SYBR Green 可与新合成的双链 DNA 结合 产生的荧光信号 与双链 DNA 成正比 SYBR Green I 荧光染料技术原理 SYBR Green I 是一种只与 DNA 双链结合的荧 光染料 当它与 DNA 双链结合时 发出荧光 从 DNA 双链上释放出来时 荧 光信号急剧减弱 因此 在一个体系内 其信号强度代表了双链 DNA 分子的 数量 SYBR Green 荧光染料法定量 PCR 的基本过程是 1 开始反应 当 SYBR Green 染料与 DNA 双链结合时发出荧光 2 DNA 变性时 SYBR Green 染料释放出来 荧光急剧减少 3 在聚合延伸过程中 引物退火并形成 PCR 产物 4 聚合完成后 SYBR Green 染料与双链产物结合 定量 PCR 系统检测 到荧光的净增量加大 SYBR Green I 荧光染料与 DNA 双链的结合 SYBR Green I 荧光染料能与所有的 DNA 双链相结合 对 DNA 模板没有选 择性 所以特异性不如 TaqMan 探针 要想用荧光染料法得到比较好的定量结 果 对 PCR 引物设计的特异性和 PCR 反应的质量要求就比较高 在此前提下 本法是一种成本低廉的选择 2 TaqMan 探针技术原理 TaqMan 探针法是高度特异的定量 PCR 技术 其核心是利用 Taq 酶的 3 5 外切核酸酶活性 切断探针 产生荧光信号 由于探针与模板是特异性结合 所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量 在 TaqMan 探针法的定量 PCR 反应 体系中 包括一对 PCR 引物和一条探针 探针只与模板特异性地结合 其结合 位点在两条引物之间 探针的 5 端标记有报告基团 Reporter R 如 FAM VIC 等 3 端标记有荧光淬灭基团 Quencher Q 如 TAMRA 等 当探 针完整的时候 报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收 仪器检测不到信 号 随着 PCR 的进行 Taq 酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针 其 5 3 外切核酸酶活性就会将探针切断 报告基团远离淬灭基团 其能量不 能被吸收 即产生荧光信号 所以 每经过一个 PCR 循环 荧光信号也和目的 片段一样 有一个同步指数增长的过程 信号的强度就代表了模板 DNA 的拷 贝数 5 TaqMan 探针的荧光信号产生机制 根据其 3 端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种 普通的 TaqMan 探针 和 TaqMan MGB 探针 MGB 探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团 Non Fluorescent Quencher 本身不产生荧光 可以大大降低本底信号的强度 同时 探针上还连接有 MGB Minor Groove Binder 修饰基团 可以将探针的 Tm 值提 高 10 C 左右 因此为了获得同样的 Tm 值 MGB 探针可以比普通 TaqMan 探 针设计得更短 既降低了合成成本 也使得探针设计的成功率大为提高 因为 在模板的 DNA 碱基组成不理想的情况下 短的探针比长的更容易设计 实验 证明 TaqMan MGB 探针对于富含 A T 的模板可以区分得更为理想 TaqMan MGB 探针 探针设计一般应符合以下条件 1 探针长度应在 20 40 个碱基左右 以保 证结合的特异性 2 G C 碱基含量在 40 60 避免单核苷酸序列的重复 3 避免与引物发生杂交或重叠 4 探针与模板结合的稳定程度要大于引物与 模板结合的稳定程度 因此探针的 Tm 值要比引物的 Tm 值至少高出 5 3 分子信标技术分子信标技术 分子信标技术 molecular beacon 也是在同一探针的两末端分别标记 荧光分子和淬灭分子 与 TaqMan 探针不同的是该探针 5 和 3 末端自身 可形成一个 8 个碱基左右的发卡结构 此时荧光分子和淬灭分子邻近 因 此不会产生荧光 当溶液中有特异模板时 该探针与模板杂交 从而破坏 了探针的发卡结构即 FRET 消失 于是溶液便产生荧光 荧光的强度与溶 液中模板的量成正比 因此可用于 PCR 定量分析 Ct 值的含义是值的含义是 每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时 所经历的循环数 研究表明所经历的循环数 研究表明 每个模板的每个模板的 Ct 值与该模板的值与该模板的 起始拷贝数的对数存在线性关系起始拷贝数的对数存在线性关系 起始拷贝数越多起始拷贝数越多 Ct 值越值越 小 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线小 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线 因此因此 只要获得未知样品的只要获得未知样品的 Ct 值值 即可从标准曲线上计算出该样即可从标准曲线上计算出该样 品的起始拷贝数 品的起始拷贝数 1 双链 双链 DNA 内插染料内插染料 常用的是常用的是 SYBR Green I 荧光染料 荧光染料 其技术原理 其技术原理 SYBR Green I 是一种只与是一种只与 DNA 双链结合的双链结合的 荧光染料 当它与荧光染料 当它与 DNA 双链结合时 发出荧光 从双链结合时 发出荧光 从 DNA 双链上释放出来时 荧光信号急剧减弱 因此 在一个体双链上释放出来时 荧光信号急剧减弱 因此 在一个体 系内 其信号强度代表了双链系内 其信号强度代表了双链 DNA 分子的数量 分子的数量 SYBR Green 荧光染料法定量荧光染料法定量 PCR 的基本过程是 的基本过程是 1 开始反应 开始反应 当当 SYBR Green 染料与染料与 DNA 双链结合时发出荧光 双链结合时发出荧光 2 DNA 变性时 变性时 SYBR Green 染料释放出来 荧光急剧减染料释放出来 荧光急剧减 少 少 3 在聚合延伸过程中 引物退火并形成 在聚合延伸过程中 引物退火并形成 PCR 产物 产物 4 聚合完成后 聚合完成后 SYBR Green 染料与双链产物结合 定量染料与双链产物结合 定量 PCR 系统检测到荧光的净增量加大 系统检测到荧光的净增量加大 荧光染料检测法一般主要是利用荧光染料 如SYBR Green I 与双链DNA分子结合 发光的特性来指示扩增产物的增加 优点是 无需另外设计荧光探针 无需特 别优化条件 简便易行 成本较低 能适用于任何一款定量PCR仪 荧光染料法 实质上是常规的PCR反应中添加了荧光染料 借助染料和双链DNA的结合所发出 的荧光实时监控反应的进程 由于不需要设计序列特异性探针和优化反应条件 价格低廉 通用性强 而且荧光染料法可用于任何一种型号的定量PCR仪 因而 同样得到广泛采用 在PCR反应体系中 加入过量SYBR Green I荧光染料 SYBR 荧光染料掺入DNA双链后荧光信号显著增强 当DNA变性时SYBR Green I染料释 放出来 荧光急剧减少 随后在聚合延伸过程中引物退火并形成PCR产物 SYBR Green染料与双链产物结合 经检测获得荧光的净增量 荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全同步 荧光染料可以在反应末尾对扩增产物进行溶解 称为溶 解曲线分析 在溶解曲线分析过程中 随着温度从低于产物溶解点缓慢升到高 于产物溶解点 定量PCR仪连续监测每个样品的荧光值 基于产物长度和基于产物长度和G CG C含含 量的不同量的不同 扩增产物会在不同的温度点解链扩增产物会在不同的温度点解链 随着产物的解链就可以看到荧光 值的降低并被仪器所测量 对溶解曲线进行微分可以计算出溶解峰 溶解峰可 以反映反应中扩增到的产物 因此用溶解曲线数据就可以进行定量检测了 将强毒株H2的RNA模板做10倍倍比稀释后 用紫外分光光度计测定其浓度 然后按下面的公式转换成模板的拷贝数 拷贝数 NDV模板浓度 阿