紫外可见分光光度法与分子荧光光度法的比较

紫外可见分光光度法与分子荧光光度法的比较 定义定义 紫外可见分光光度法 根据被测量物质分子对紫外 可见波段范围 150 800 纳米 单色辐射的吸收或反射强度来进行物质的定性 定量 或结构分析的一种方法 分子荧光光度法 利用物质吸收较短波长的光能后发射较长波长特征光谱 的性质 对物质定性或定量分析的方法 可以从发射光谱或激发光谱进行 分析 组成部件组成部件 紫外可见分光光度法 辐射源 必须具有稳定的 有足够输出功 率的 能提供仪器使用波段的连续光谱 如钨灯 卤钨灯 波长范围 350 2500 纳米 氘灯或氢灯 180 460 纳米 或可调谐染料激光光 源等 单色器 它由入射 出射狭缝 透镜系统和色散元件 棱镜或光 栅 组成 是用以产生高纯度单色光束的装置 其功能包括将光源产生的 复合光分解为单色光和分出所需的单色光束 试样容器 又称吸收池 供盛放试液进行吸光度测量之用 分为石英池和玻璃池两种 前者适用于 紫外到可见区 后者只适用于可见区 容器的光程一般为 0 5 10 厘米 检测器 又称光电转换器 常用的有光电管或光电倍增管 显 示装置 这部分装置发展较快 较高级的光度计 常备有微处理机 荧 光屏显示和记录仪等 可将图谱 数据和操作条件都显示出来 分子荧光光度法 激发光源 单色器 样品池 检测器和记录显示部分 1 光源 能发射紫外到可见区波长的光 强度大 稳定 常用的有溴钨 灯 高压汞灯 氙灯 2 单色器 两个单色器 3 样品池 通常用石英 制成 4 检测器 光电倍增管 常见类型常见类型 紫外可见分光光度法 1 单光束 简单 价廉 适于在给定波长处 测量吸光度或透光度 一般不能作全波段光谱扫描 要求光源和检 测器具有很高的稳定性 2 双光束 自动记录 快速全波段扫描 可消除光源不稳定 检测器灵敏度变化等因素的影响 特别适合于 结构分析 仪器复杂 价格较高 3 双波长 将不同波长的两束单 色光 1 2 快束交替通过同一吸收池而后到达检测器 产生交 流信号 无需参比池 1 2nm 两波长同时扫描即可获得导数 光谱 分子荧光光度法 1 光电荧光计 用滤光片作单色器 激发滤光片 和荧光光片 溴钨灯或高压汞灯作光源 光电管为检测器 2 荧 光分光光度计 用氙灯作光源 光栅作单色器 光电倍增管为检测 器 可连续扫描激发光谱和荧光光谱 原理 原理 紫外可见分光光度法 紫外 可见吸收光谱通常由一个或几个宽 吸收谱带组成 最大吸收波长 max 表示物质对辐射的特征吸收 或选择吸收 它与分子中外层电子或价电子的结构 或成键 非键 和反键电子 有关 朗伯 比尔定律是分光光度法和比色法的基础 这个定律表示 当一束具有 I0 强度的单色辐射照射到吸收层厚度为 b 浓度为 c 的吸光物质时 辐射能的吸收依赖于该物质的浓度与吸 收层的厚度 其数学表达式为 式中的 A 叫做吸光度 I0 为入射 辐射强度 I 为透过吸收层的辐射强度 I I0 称紫藤为透射率 T 是一个常数 叫做摩尔吸光系数 值愈大 分光光度法测 定的灵敏度愈高 分子荧光光度法 分子吸收能量后 从基态最低振动能级跃迁到第 一电子激发态或更高电子激发态的不同振动能级 这一过程速度很 快 大约 10 15 s 成为激发单重态分子 激发态分子不稳定 可 以通过以下几种途径释放能量返回基态 1 振动驰豫 这一过程 只能发生在同一电子能级内 即分子通过碰撞以热的形式损失部分 能量 从较高振动能级下降到该电子能级的最低振动能级上 由于 这一部分能量以热的形式释放 而不是以光辐射形式发出 故振动 驰豫属于无辐射跃迁 2 内转换 即激发态分子将多余的能量转 变为热能 从较高电子能级降至较低的电子能级 内转换也属于无 辐射跃迁 3 荧光 较高激发态分子经无辐射跃迁降至第一电子激发单重态的最低振动 能级后 仍不稳定 停留较短时间后 约 10 8 s 称作荧光寿命 以光辐射形式放出能量 回到基态各振动能级 这时所发射的光称 为荧光 当然也可以无辐射跃迁形式返回基态 4 系间窜跃 有些 物质的激发态分子通过振动驰豫和内转换下降到第一电子激发态的 最低振动能级后 有可能经过另一个无辐射跃迁转移至激发三重态 这一过程伴随着自旋方向的改变 称为系间窜跃 对于大多数物质 系间窜跃是禁阻的 如果分子中有重原子 如 I Br 等 存在 由 于自旋 轨道的强偶合作用 电子自旋方向可以改变 系间窜跃就变 得容易了 荧光的检测 光源发出的紫外可见光通过激发单色器分 出不同波长的激发光 照射到样品溶液上 激发样品产生荧光 样 品发出的荧光为宽带光谱 需通过发射单色器分光后再进入检测器 检测不同发射波长下的荧光强度F 由于激发光不可能完全被吸收 可透过溶液 为了防止透射光对荧光测定的干扰 常在与激发光垂 直的方向检测荧光 因荧光是向各个方向发射的 激发与荧光光 谱的形成 任何荧光物质 都具有两种特征光谱 即激发光谱 excitation spectrum 和荧光发射光谱 fluorescence emission spectrum 荧光光谱 又称发射光谱 保持激发光波长不变 即固定激发单色 器 依次改变荧光发射波长 测定样品在不同波长处发射的荧光 强度F 以发射波长为横坐标 以荧光强度F为纵坐标作图 得到 荧光发射光谱 荧光发射光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是 最大发射波长 灵敏度灵敏度 紫外可见分光光度法 灵敏度很高 达 0 00001 0 mol L 分子荧光光度法 由于分子荧光是从入射光的直角方向入射 因而 灵 敏度要比紫外可见高 2 4 个 数量级 它的测定下限在 0 1 0 001ug mL 选择性选择性 紫外可见分光光度法 一个物质若含有生色基团 它就会产生紫外 和可见吸收 反过来根据紫外 可见吸收光谱便可判断某些官能团的 存在 即进行官能团的鉴别 紫外 可见吸收光谱的获得是建立在测 定出物质对不同波长光 单色光 吸收的基础上的 选择性较高 分子荧光光度法 一个物质只要能产生荧光 则可以根据荧光光谱判 别物质的种类 前提是量子产率达到要求 因而选择性较高 但由 于不是所有物质都有荧光光谱 应用有一定限制 影响因素影响因素 紫外可见分光光度法 1 共轭效应 共轭效应越强 能量差越小 最大吸收波长想长波方向 吸收强度也增大 2 立体化学校应 包括 空间位阻和跨环效应 均有影响 3 溶剂的影响 在溶液中物质是溶 剂化的 影响了溶质分子的自由转动 引起光谱结构精细结构的消失 4 体系 PH 的影响 无论是酸性碱性 体系的 PH 对紫外可见光谱的影 响是普遍的现象 分子荧光光度法 1 跃迁类型 物质必须在紫外可见区有强吸收和高 荧光效率才能产生荧光 具有 跃迁的分子才有强吸收 跃迁的 大 2 共轭效应 大多数能产生荧光的物质都含有芳香环 或杂环 具有共轭的 跃迁 其共轭程度愈大 荧光效率也愈 大 且最大激发和发射波长都向长波长方向移动 如苯 萘 蒽三种 物质 3 刚性平面结构 当荧光分子共轭程度相同时 分子的刚性和 共平面性越大 荧光效率越大 有些物质本身不发荧光或荧光较弱 但和金属离子形成配合物后 如果刚性和共平面性增加 就可以发荧 光或增强荧光 如 8 羟基喹啉是弱荧光物质 与 Mg2 Al3 等金属 离子形成的配合物的荧光增强 利用这一特点可以间接测定金属离子 4 取代基团 荧光分子上的各种取代基对分子的荧光光谱和荧光强 度都有很大影响 给电子取代基如 NH2 OH OCH3 CN NHR NR2等 能增加分子的 电子共轭程度 使荧光效率提高 而 COOH NO2 C O F Cl 等吸电子取代基 可减弱分子 电子共轭性 使荧光减弱甚至熄灭 还有一类取代基则对荧光的 影响不明显 如 R 5 温度 温度对被测溶液的荧光强度有明显的 影响 当温度升高时 介质粘度减小 分子运动加快 分子间碰撞几 率增加 从而使分子无辐射跃迁增加 荧光效率降低 故降低温度有 利于提高荧光效率及荧光强度 6 溶剂 同一种荧光物质在不同的 溶剂中 其荧光光谱的位置和荧光强度可能会有一定的差别 尤其是 那些分子中含有极性取代基的荧光物质 它们的荧光光谱易受溶剂的 影响 6 溶液的酸度 pH 值 对荧光物质的影响可以分两个方面 1 若荧光物质本身是弱酸或弱碱时 溶液 pH 值改变 物质分子和其 离子间的平衡也随之发生变化 而不同形体具有其各自特定的荧光光 谱和荧光效率 例如苯胺 2 对于金属离子与有机试剂生成的荧光 配合物 溶液 pH 值的改变会影响配合物的组成 从而影响它们的荧 光性质 例如 Ga3 离子与邻 二羟基偶氮苯 在 pH3 4 的溶液中形成 1 1 配合物 能产生荧光 而在 pH6 7 的溶液中 则形成 1 2 的配合 物 不产生荧光 误差来源误差来源 紫外可见分光光度法 偏离比尔定律 仪器本身的测量误差 偏离 比尔定律的原因 1 比尔定律本身的局限 仅在单色光下成立 2 非单色入射光引起的偏离 比尔定律仅在入射光为单色光时才成 立 事实上单色器很难将光源的连续光色散成其正的单色光 而是具有 较窄波长范围的复合光 光通量为 0 01 5nm 还有溶液的化学偏 离 由于被测物质在溶液中发生缔合 离解 互变异构 生成逐级 配合物等化学原因造成对比尔定律的偏离 分子荧光光度法 荧光熄灭 由于荧光物质分子间或与其它物质相 互作用 引起荧光强度显著下降的现象叫做荧光熄灭 quenching 或猝灭 引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂 如卤素离子 重金 属离子 氧分子 硝基化合物 重氮化合物和羧基化合物等 注意事项注意事项 紫外可见分光光度法 显色温度 显色时间 溶剂的影响 合适的 PH 分子荧光光度法 激发波长的选择 激发时间的选择 常闭物质的 选择等 分析方法分析方法 紫外可见分光光度法 定性分析 根据吸收光谱的形状 吸收峰的 数目 用经验规则计算 max 与测定的 max比较 比较未知物与 标准物质在相同化学环境与测量条件下的紫外 可见吸收光谱 若吸 收光谱的形状 吸收峰的数目 max max完全相同 就可 以确定未知物与标准物质具有相同的生色团与助色团 但并不能断 定两者为同一化合物 结构分析 根据官能团特征波普来判断 定 量分析 比尔定律 可利用工作曲线求解 多组分同时测定时 可 用吸光度加和性求解 分子荧光光度法 定性分析 荧光物质的特征光谱包括激发光谱和 荧光光谱 因此用它鉴定物质比吸收光谱可靠 定量分析 标准曲 线法和直接比较法 应用应用 紫外可见分光光度法 无机阴 阳离子的测定 利用高灵敏 高选择性的有机显色剂 与被测无机离子发生配合或 氧化还原反应 可测定周期表中绝大多数元素 两组分的同时测定 例 临床中麻醉剂 普鲁卡因丁卡因注射液 它含有两种成分 盐酸普鲁卡因和盐酸丁卡因 这两种化合物结构相似 最大吸收波长分别为 291 和 312nm 但盐 酸丁卡因的毒性比前者大 10 倍 因此配制时应严格限制其含量 可 采用双波长 利用吸光度具有加和性来测定和求解 以减少二种化 合物吸收峰重叠而产生的测量误差 有机化合物的定量分析有机化合物的定量分析 直接法 若有机化合物本身在结构上含有双键或芳环 即含有共轭 电子 则可直接测定其含量 如微量氨基酸的测定 氨基酸的吸收 波长在 280nm 左右 且 较小 低含量的氨基酸很难用直接法准确 测定 可用茚三酮与各种氨基酸反应 生成无色还原型茚三酮 过 量的茚三酮又与还原型茚三酮和氨缩合生成紫蓝色产物 称为 Ruhemann 紫 lmax 570nm 利用此反应可测微量的氨基酸 分子荧光光度法 有机物的荧光分析 由于荧光分析的高灵敏度 高选择性 使它在医学检验 卫生检验 药物分析 环境检测及食 品分析等方面有广泛的应用 芳香族及具有芳香结构的物质芳香族及具有芳香结构的物质 在紫外光照射下能产生荧光 因此 荧光分析法可直接用于这类有机物的测定 如 多环胺类 萘酚类 嘌呤类 吲哚类 多环芳烃类 具有芳环或芳杂环结构的氨基酸及 蛋白质等 约有 200 多种 食品中维生素含量的测定食品中维生素含量的测定是食品分析的 常规项目 几乎所有种类的维生素都可以用荧光法进行分析 多环 芳烃普遍存在于大气 水 土壤 动植物及加工食品中 大家所熟 知的苯并 a 芘是致癌活性最强的一种 通过萃取或色谱分离后 可 采用荧光法进行测定 该方法准确可靠 测定最低浓度可达 0 1 g ml 应用实例 食品中 VB2 核黄素 的测定 其测定原理是 VB2在 440 500 nm 波长的光照射下 发出黄绿色荧光 在波长 525 nm 下测定其荧光强度 在稀溶液中其荧光强度与 VB2的浓度成正比 为消除试液中共存荧光杂质的干扰 可在测定过荧光强度的溶液中 加入连二亚硫酸钠 Na2S2O4 将 VB2还原为无荧光的物质 然后再 测定试液中残余的荧光杂质的荧光强度 两者之差即为食品中 VB2 的荧光强度 该方法被作为食品分析的国家标准分析方法 无机元素的荧光分析无机元素的荧光分析 能产生荧光的无机物较少 对其进行分析通 常是将待测元素与荧光试剂反应 生成具有荧光特性的配合物 进 行间接测定 目前利用该法可进行荧光分析的无机元素已近 70 种 常见的有铬 铝 铍 硒 锗 镉等及部分稀土元素 例如 Al3 与 桑色素或 8 羟基喹啉的配合物就可产生荧光 从而用于铝的测定 有些元素虽不能与有机试剂形成能产生荧光的配合物 但它可使荧 光物质的荧光熄灭 例如 F 离子在一定 pH 的溶液中 能从 Al3 与桑 色素的荧光配合物中夺取 Al3 从而导致荧光配合物的荧光强度降 低 其荧光强度与 F 离子的浓度成反比 利用这一性质可间接测定 样品中的氟离子含量 在生命科学中的应用在生命科学中的应用 荧光分析法常用于临床测定生物样品中某些 成分的含量 由于这些物质荧光量子产率较低 所以常用各种荧光 探针来间接测定 荧光探针还被广泛应用于研究蛋白质大分子构象 及构象动力学信息 此外 荧光光谱可用以研究 DNA 的烷基化损伤 与修复 荧光偏振 荧光猝灭及多维荧光检测技术可用来研究蛋白 质与配体之间的相互作用及动力学 时间分辨荧光免疫技术越来越 多地用于许多蛋白质 激素 病毒抗原乃至 DNA 杂交体等的分析 总之 荧光分析法在生命科学领域中的应用前景十分广阔 相关论文摘录相关论文摘录 紫外可见分光光度法 紫外可见分光光度法测定地表水和