实验1---大肠杆菌的培养和分离

1 实验实验 1 大肠杆菌的培养和分离大肠杆菌的培养和分离 高二年级 班 姓名 学号 实验日期 月 日 知识准备知识准备 1 背景知识 大肠杆菌 Escherichia coli E coli 是微生物学和遗传学常用的实验材料 为单细胞原核 生物 宽约 0 5 1 3 微米 具有由肽聚糖组成的细胞壁 周身具鞭毛 能运动 大肠杆菌是在人和动物肠道中生活的 不会致病的正常栖居菌 但若进入胆囊 膀胱等处也会 引起炎症 它能利用多种糖类物质产酸 产气 其代谢类型为异养兼性厌氧型 其代谢活动能产生 大肠杆菌素 抑制肠道内其他分解蛋白质的微生物生长 还能合成维生素 B 和 K 它们在肠道中大 量繁殖 几乎占粪便干重的 1 3 实验室中用于培养微生物的营养物质称为培养基 按培养基的物理状态可分为 液体培养基和 固体培养基 将已知的菌种引入新配制的培养基的过程称为接种 而在固体培养基表面用蘸有菌种 的接种环连续划线 既可以达到接种的目的 又可以实现分离菌种的目的 这是因为划线过程中接 种环与培养基表面接触 接种环上的菌液逐渐减少 因此划线最后部分细菌间的距离加大 经过培 养后可出现由单个细菌细胞形成单菌落 这样就达到了分离细菌的目的 2 实验原理 使用通用的细菌培养基 如 LB 液体培养基 可扩大培养大肠杆菌 使大肠杆菌迅速扩增 在 LB 固体平面培养基上对大肠杆菌进行划线分离 经培养后培养基上每一个菌体会形成一个单 独的菌落 这是消除污染杂菌的通用方法 也是用于筛选突变菌株的最简便方法之一 为保证配制的培养基上只生长大肠杆菌 而不被其他微生物污染 实验过程中要进行无菌操作 3 思考题 1 为什么培养过程中会出现被其他微生物污染的现象 2 进行了无菌操作是否肯定就不会出现被其他微生物污染的现象吗 3 本实验的关键步骤 划线分离的目的是什么 4 在做第二次以及其后的划线操作时 为什么总是从上一次划线的末端开始划线 在 操作过程中应注意什么 2 实验目的 1 利用液体培养基进行大肠杆菌的扩增 2 用固体平面培养基进行大肠杆菌的划线分离 3 了解微生物实验的操作原理和培养条件 材料用具 大肠杆菌菌种 装有固体培养基的 已灭菌培养皿 装有 LB 液体培养基的 已灭菌的 250ml 三角 瓶封口膜和橡皮圈 酒精灯 接种环 镊子 装有酒精棉球的广口瓶 恒温培养箱 摇床 操作流程操作流程 实验步骤实验步骤 1 接种前的准备 进行接种操作前 应先洗手 再用 70 的酒精棉球擦拭双手和桌面 待酒精挥发之后 再点燃酒精灯 2 接种 1 接种时的要求 接种过程要在酒精灯火焰附近完成 这是因为在火焰附近形成的上升气流能避免空 气中的微生物落入培养基中 接种环灭菌 将接种环在酒精灯火焰的外焰灼烧灭菌 对金属丝与柄部连接部位也 要在火焰上穿梭 1 2 次 灼烧后的接种环温度较高 为避免烫死菌种 可将其接触培 养基或培养容器的内壁冷却后再取菌种 2 将固体培养基表面的大肠杆菌菌种转入液体培养基培养 右手执接种环 在火焰上灭菌 用左手握住装有菌种的试管和液体培养基的三角瓶 靠近酒精灯火焰 并用右手中指 无名指夹下试管口的棉塞 无名指 小指夹下三角瓶的 封口膜 将试管口和三角瓶口在酒精灯的火焰上烧灼灭菌后 再将接种环伸入试管 接 触培养基冷却后取菌种 将菌种转入三角瓶的液体培养基中 分别将三角瓶的封口膜和 试管的棉塞复原 在封口膜上标记好接种人和接种日期 3 将液体培养基中的大肠杆菌菌种转入固体培养基中划线分离 接种时应以左手持培养皿 在火焰旁用左手拇指 食指及中指使皿盖开启成一缝 培养皿盖不能开大 以避免杂菌落入 用灭菌过的接种环取少许菌种迅 速送入培养皿内 在固体培养基的表面连续平行划线 4 5 条 将培养皿转动一定角度后 用接种环通过 第 1 次划线的末端部分做第 2 次连续平行划线 然后 再以同样方法依次操作 见右图 划线时接种环应与培养基表面成 30 左右 注意划线要轻 不可把培养基划破 也 灭菌 消毒划线 接 种 培养 观 察 3 不要使接种环碰到培养皿边缘 见右下图 3 培养 1 将接有菌种和液体培养基的三角瓶在摇床上振荡培养 12h 温度控制在 37 左右 2 将划线后的固体培养基盖好 在培养皿盖上标记好接种人和接种日期 再将 培养皿在 37 恒温培养箱中倒置培养 12 24h 倒置培养的原因是 恒温培养时 培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发 并在培 养皿盖子内凝结成水滴 水滴如果滴落在培养基表面并扩散开来 则会使不同菌落中的 菌随水扩散 很难再分成单菌落 达不到分离目的 培养 12 24h 后 若在划线的末端出现不连续的单个菌落 表明菌种已被分离 实验记录实验记录 请课代表将在 37 恒温培养箱中培养 12 24h 的培养结果用相机拍摄下来 传给任课教 师 结果分析 1 你的培养基上是否有杂种污染 如何判断 2 用液体培养基与用固体培养基培养时有什么不同 原因是什么 创新空间 你对于本实验的过程和结果有何疑问 对于实验步骤有何改进建议 请将它们写在这里 我们将共同提高 实验考核实验考核 检查人 检查人 项目 实验预习实验操作实验安全实验清理实验结果总评 成绩 其它 4 预习作业预习作业 1 进行接种操作前 应先洗手 再用 擦拭 和桌面 点燃酒精灯应 等待 之后再进行 2 倒平板和接种 都要靠近酒精灯火焰附近操作 这是因为 3 接种时 接种环灭菌要特别将 在火焰上穿梭 1 2 次进行灭菌 灼烧 后的接种环温度较高 为避免烫死菌种 可将其接触 冷却后再取样和接种 4 接种划线 在固体培养基的表面连续划线 条 将培养皿转动一定角度后 用接 种环通过第 1 次划线的 做第 2 次连续平行划线 然后再以同样方法依次操作 划线时要轻 不可 也不要使接种环碰到培养皿边缘 划线后盖好培养皿 将培养皿 将培养皿放入恒温培养箱中在 培养 12 24h 或在室温下培养 3d 实验中需将培养皿倒置的原因是 在培养皿盖子内凝结成的水滴如果滴落在培养基表面并扩散 开来 会使 很难再分成单菌落 达不到分离的目的 5 将大肠杆菌菌种由固体转入液体培养基后应将三角瓶放在 上振荡培养 12h 温度 控制在 左右 课后作业课后作业 1 下列有关实验材料大肠杆菌的叙述 不正确的是 A 属于单细胞的原核生物 B 在固体培养基表面可见其细胞 C 细胞壁成分与植物不同 D 细胞中含有 DNA 和 RNA 2 微生物实验中分别采用了高压蒸气 酒精 火焰灼烧等几种不同的灭菌处理 这些方法依次可以 用于杀灭什么部位的杂菌 A 接种针 手 培养基 B 高压锅 手 接种环 C 培养基 手 接种环 D 接种针 手 高压锅 3 在获得某种细菌纯净培养物的过程中 操作的关键是 A 对所有器皿 培养基灭菌 B 接种纯种细菌 C 适宜环境条件下培养 D 防止外来杂菌污染 4 微生物实验过程中 常需灭菌 下列灭菌操作中 错误的是 A 用酒精擦拭双手 B 用氯气消毒实验用水 C 实验操作应在酒精灯火焰附近进行 D 用酒精擦拭玻璃器皿 5 有关划线接种操作的正确做法是 A 接种环 培养皿等已灭菌 整个操作过程中不再灭菌 B 取出菌种后需马上塞上棉塞 然后再划线 C 用沾有菌种的接种环迅速划三至五条平行线即可 D 最后将培养皿倒置 放入培养箱中培养 6 下面是有关细菌划线分离法的叙述 其中正确的是 A 必须在液体培养基上操作 B 划线上一定会出现单个突变菌株 C 此法不能除去污染的杂菌 D 划线上一定会出现细菌单菌落 7 将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入 37 恒温箱的目的是 A 对比观察培养基有没有被微生物利用 B 对比分析培养基是否被杂菌污染 5 C 没必要放入未接种的培养基 D 为了下次接种时再使用 实验实验 2 2 分离以尿素为氮源的微生物分离以尿素为氮源的微生物 高二年级 班 姓名 实验组编号 实验日期 月 日 知识准备 1 背景知识 脲或称尿素 是蛋白质降解的产物 人和其他哺乳动物如家畜的尿中都含有尿素 自然界中有能够分解尿素的微生物 例如 土壤中有一些细菌含有脲酶 通过降解尿素 作为其生长的氮源 2 实验原理 1 利用选择培养基分离得到以尿素作为唯一氮源的细菌 选择培养基 在培养基中加入某种化学物质 以抑制不需要的微生物的生长 促进 所需要的微生物的生长 目的是从多种微生物中分离得到所需要的微生物 在本课题提供的选择培养基的配方中 尿素是培养基中的惟一氮源 因此 原则上 只有能够利用尿素的微生物才能够生长 2 利用稀释涂布平板法统计菌落 用一定稀释度的样品溶液在培养基上进行涂布 当样品的稀释度足够高时 培养基 表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌 通过观察菌落数可以确定样品中 的细菌数量 恰当的稀释度是成功地统计菌落的关键 一般来讲 每个培养皿中有 20 个以内的菌落适于计数 为保证结果的可信度 在同一稀释度下 至少要对 3 个平板进 行重复计数 求出平均值 样品中细菌数量的计算方法是 平均菌落数平均菌落数 涂布的稀释液体积涂布的稀释液体积 稀释倍数稀释倍数 3 利用鉴别培养基确定细菌种类 在细菌分解尿素的化学反应中 细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨 氨会使培养基 的碱性增强 pH 升高 因此 我们可以通过检测培养基 pH 变化来判断该化学反应是否 发生 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂 培养某种细菌后 如果 pH 升 高 指示剂将变红 说明该细菌能够分解尿素 3 思考题 1 农作物不能直接吸收利用尿素 但尿素却是农业生产上的重要氮肥 农作物 如何利用尿素中的氮 2 怎样从杂菌中分离得到能利用尿素的细菌 3 怎样确定单位体积稀释液中细菌的数量 4 如何确定培养基中生长的细菌能够分解尿素 6 实验目的实验目的 1 使用专一的培养基 含尿素 分离专一的细菌 有脲酶的细菌 2 使用指示剂颜色的变化检知酶 脲酶 所催化的反应 3 使用稀释平板法统计菌落数 材料用具材料用具 尿素固体培养基和 LB 固体培养基 10 2和 10 3土壤稀释液 70 酒精及酒精棉 试管架 有塞试管 广口瓶 镊子 玻璃刮刀 酒精灯 移液器 培养皿 三角瓶 操作流程操作流程 实验步骤实验步骤 请在实验前预习并填写 请在实验前预习并填写 1 用镊子夹取酒精棉 将手及实验台擦拭干净 待 后点燃酒精灯 2 制备培养基 将两个三角瓶中已灭菌的 LB 固体培养基和尿素固体培养基 在 左右时 在 旁分别倒入两个培养皿中 在水平的超净台上摇匀 至凝固 3 制备细菌悬液 将 1g 土样加入盛有 ml 无菌水的三角瓶中 振荡 min 即成 稀释液 吸取上清液 ml 转移至盛有 mL 的无菌水的无菌大试管中 依此方法制备出 稀释液 摇匀 放在试管架上 4 用涂布法分离细菌 取样时 尽量只取 并按照稀释液浓度由低到高由低到高的顺序分别吸取 ml 土壤稀释液加到 培养基和 培养基的培养皿中 不必更换移液管 再将 保存在 酒精中的 放在 上 待刮刀上火焰熄灭 在 旁打开培养皿 将菌落涂布在 上 5 细菌的计数 将涂布好的培养皿顶盖上写明实验内容 接种人姓名和接种日期后倒置 放在 37 温度下培养 h 观察并记录菌落数 实验记录和数据处理实验记录和数据处理 1 有菌落的尿素培养基颜色变化是 由 色变成 色 制备培养基制备细菌悬液涂布法分离细菌统计菌落数 7 2 培养基中菌落数目的统计和计算 稀释度 培养基 10 2稀释度10 3稀释度 LB 培养基菌落数 样品各种细菌的数目 尿素培养基菌落数 样品中以尿素为氮源的 细菌的数目 实验结论实验结论 该样品中 含有 不含有 能分解尿素的细菌 含量约为 个 g 创新空间 你对于本实验的过程和结果有何疑问 对于实验步骤有何改进建议 请将它们写在 这里 我们将共同提高 实验考核实验考核 检查人 检查人 课课 后练后练 习习 1 下 列氮 肥能 被植物直接吸收的是 硝酸盐 尿素 磷酸二氢氨 氨 A B C D 项目 实验预习实验操作实验安全实验清理实验结果总评 成绩 其它 8 2 土壤中分解尿素的微生物所需氮源为 A 硝酸 B 氨 C 尿素 D 蛋白胨 3 将某种细菌接种到彻底灭菌的固体培养基上 经过一段时间后能得到 A 无一定形态的群体 B 菌丝 C 单个细菌 D 菌落 4 以下叙述中对尿素培养基进行灭菌的不正确操作是 A 对配制好的尿素培养基进行高压蒸汽灭菌 B 用内置滤膜的玻璃漏斗过滤尿素溶液 C 对除尿素以外的培养基成份进行高压蒸汽灭菌 D 在 60 时 把灭菌后的尿素溶液和其它培养基成份混合 5 从土壤中分离能分解尿素的细菌 可以利用选择培养基 其成分中一定有 尿素 有机氮化合物 无机盐 有机碳化合物 水 无机的碳化合物 A B C D 6 用来判断选择培养基是否起到了选择作用 需要设置的对照是 A 未接种的选择培养基 B 未接种的 LB 培养基 C 接种了的 LB 培养基 D 接种了的选择培养基 7 利用稀释平板法进行菌落计数时 使用的培养基种类应该是什么 为保证计数准确 形成一个菌落的最初细菌数应该是多少 A 液体培养基 一个细菌 B 液体培养基 许多细菌 C 固体培养基 一个细菌 D 固体培养基 许多细菌 8 利用稀释平板法进行菌落计数时 培养皿中长满了大小不一的菌落 数量有 4