食品中维生素B6的测定

GB xxxxxxxx食品安全国家标准食品中维生素B6的测定（征求意见稿）201x-xx-xx实施201x-xx-xx发布中华人民共和国卫生部 发布1.1.1.1 2010-06-01实施2010-发布 前 言本标准代替GB/T 5009.154-2003食品中维生素B6的测定、GB 5413.13-2010食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素B6的测定。本标准与GB/T 5009.154-2003、GB 5413.13-2010相比，主要变化如下： 标准名称修改为“食品安全国家标准 食品中维生素B6的测定”；标准规定了两种方法：第一法为高效液相色谱法，第二法为微生物法；统一了样品制备方法；在附录中增加了维生素B6（吡哆醇、吡哆醛、吡多胺）标准储备溶液的校正方法。9食品安全国家标准食品中维生素B6的测定1 范围本标准规定了食品中维生素B6的测定方法。本标准第一法为高效液相色谱法，第二法为微生物法，适用于食品中维生素B6的测定。第一法 高效液相色谱法2 原理试样在稀酸环境中高温水解，定容过滤后经反相色谱柱分离样液中维生素B6的三种衍生物（吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛），高效液相色谱-荧光检测器检测，以保留时间定性，外标法定量。3 试剂和材料注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。3.1 试剂3.1.1 庚烷磺酸钠（C7H15NaO3S）。3.1.2 冰乙酸（C2H4O2）。3.1.3 三乙胺（C6H15N）：色谱纯。3.1.4 甲醇（CH3OH）：色谱纯。3.1.5 盐酸（HCl）。3.1.6 硫酸（H2SO4）。3.1.7 氢氧化钠（NaOH）。3.2 试剂配制3.2.1 盐酸溶液（0.1 mol/L）：量取9 mL盐酸，用水稀释并定容至1000 mL。3.2.2 硫酸溶液（0.2 mol/L）：于2000 mL烧杯中加入700 mL水，11.2 mL硫酸，用水稀释至1000 mL。3.2.3 硫酸溶液（0.5 mol/L）：于2000 mL烧杯中加入700 mL水，28 mL硫酸，用水稀释至1000 mL。3.2.4 氢氧化钠溶液（10 mol/L）：准确称取200 g氢氧化钠，加400 mL水溶解后，用水定容至500 mL。3.3 标准品3.3.1 盐酸吡哆醇（C8H12ClNO3, CAS: 58-56-0）标准品：纯度99%。3.3.2 盐酸吡哆醛（C8H10ClNO3, CAS: 65-22-5）标准品：纯度99%。3.3.3 双盐酸吡哆胺（C8H14Cl2N2O3, CAS: 524-36-7）标准品：纯度99%。3.4 标准溶液配制3.4.1 吡哆醇标准储备液（1 mg/mL）：准确称取60.8 mg盐酸吡哆醇标准品，用0.1 mol/L盐酸溶液溶解后定容到50 mL，在-20 冰箱中避光贮存，保存期1个月。标准储备液在使用前需要进行浓度校正，校正方法参照附录A。3.4.2 吡哆醛标准储备液（1 mg/mL）：准确称取60.9 mg盐酸吡哆醛标准品，用0.1 mol/L盐酸溶液溶解后定容到50 mL，在-20 冰箱中避光贮存，保存期1个月。标准储备液在使用前需要进行浓度校正，校正方法参照附录A。3.4.3 吡哆胺标准储备液（1 mg/mL）：准确称取71.7 mg双盐酸吡哆胺标准品，用0.1 mol/L盐酸溶液溶解后定容到50 mL，在-20 冰箱中避光贮存，保存期1个月。标准储备液在使用前需要进行浓度校正，校正方法参照附录A。3.4.4 维生素B6混合标准中间液（20 g/mL）：分别准确吸取吡哆醇、吡哆醛、吡多胺的标准储备液各1.00 mL，用0.1 mol/L盐酸溶液稀释并定容至50 mL。临用前配制。3.4.5 维生素B6混合标准系列工作液：分别准确吸取维生素B6混合标准中间液0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、5.0 mL，至100 mL容量瓶中，用水定容。该标准系列浓度分别为0.00 g/mL、0.20 g/mL、0.40 g/mL、0.60 g/mL、1.00 g/mL。临用前配制。4 仪器和设备4.1 高效液相色谱仪，带荧光检测器。4.2 天平：感量1 mg和0.01 mg。4.3 高压釜。4.4 pH计：精度0.01。4.5 涡旋混合器。4.6 超声波振荡器。4.7 分光光度计。5 分析步骤5.1 试样制备 5.1.1 试样预处理试样切碎后用组织捣碎机均质；颗粒状试样磨成粉混匀。试样预处理过程中要避免试样长时间处于高温环境下。取粉碎均质后的试样500 g，分装入洁净棕色磨口瓶中，密封，并做好标记，避光低温存放备用。5.1.2 试样溶液的制备称取试样210.0 g（精确至0.01 g）放入100 mL 三角瓶中，加约60 mL 0.2 mol/ L硫酸溶液。放入高压釜121 下水解3 h，取出冷却，用10.0 mol/L氢氧化钠溶液和0.5 mol/L硫酸溶液调pH值至1左右，将三角瓶内的溶液转移到100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100 mL，滤纸过滤（前5 mL滤液舍弃），高效液相色谱仪进样检测前要过0.22 m微孔滤膜。注：操作过程应避免强光照射。5.2 仪器参考条件5.2.1 色谱柱：C18柱，150 mm 4.6 mm，5 m，或等效者。5.2.2 流动相：甲醇50 mL，庚烷磺酸钠2.0 g，三乙胺2.5 mL，用水溶解并定容到1000 mL后，用冰乙酸调pH至3.00.1，过0.45 m微孔滤膜加压过滤。5.2.3 流速：1 mL/min。5.2.4 柱温：35 C。5.2.5 检测波长：激发波长293 nm，发射波长395 nm。5.2.6 进样体积：10 L。5.3 标准曲线的制作将维生素B6混合标准系列工作液分别注入高效液相色谱仪中，测定各组分的峰面积，以相应标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。5.4 试样溶液的测定将试样溶液注入高效液相色谱仪中，得到各组分相应的峰面积，根据标准曲线得到待测试样溶液中维生素B6各组分的浓度，平行测定次数不少于两次。6 分析结果的表述试样中维生素B6各组分的含量按公式（1）计算： （1）式中：Xi 试样中维生素B6各组分的含量，单位为毫克每百克（mg/100 g）；Ci 标准工作液中维生素B6各组分的浓度，单位为微克每毫升（g/mL）；A 试样溶液中维生素B6各组分的峰面积；V 试样溶液的最终定容体积，单位为毫升（mL）；AS 标准工作液中维生素B6各组分的峰面积；m 试样质量，单位为克（g）。试样中维生素B6的含量按式（2）计算： （2）式中：X 试样中维生素B6（以吡哆醇计）的含量，单位为毫克每百克（mg/100 g）；X醇 试样中吡哆醇的含量，单位为毫克每百克（mg/100 g）；X醛 试样中吡哆醛的含量，单位为毫克每百克（mg/100 g）；X胺 试样中吡哆胺的含量，单位为毫克每百克（mg/100 g）；1.012 吡哆醛的含量换算成吡哆醇的系数。1.006 吡哆胺的含量换算成吡哆醇的系数。计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字（或小数点后两位）。7 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。8 其他方法检出限为：吡哆醇0.02 mg/100 g，吡哆醛0.02 mg/100 g，吡多胺0.02 mg/100 g；定量限为吡哆醇0.05 mg/100 g，吡哆醛0.05 mg/100 g，吡多胺0.05 mg/100 g。第二法 微生物法9 原理 食品中某一种细菌的生长必须要有某一种维生素的存在，卡尔斯伯（Saccharomyces Carlsbrgensis）酵母菌在有维生素B6存在的条件下才能生长，在一定条作下维生素B6的量与其生长呈正比关系。用比浊法测定该菌在试样液中生长的浑浊度，与标准曲线相比较得出试样中维生素B6的含量。10 试剂和材料10.1 试剂注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。10.1.1 乙醇（C2H6O）。10.1.2 硫酸（H2SO4）。10.1.3 氢氧化钠（NaOH）。10.1.4 吡哆醇Y培养基：不得含维生素B6生长因子。10.1.5 琼脂（(C12H18O9)n）。10.1.6 氯化钠（NaCl）。10.1.7 溴甲酚绿（C21H14Br4O5S）。10.2 试剂配制10.2.1 乙醇溶液（25%）：吸取250 mL乙醇，用水稀释至1000 mL。10.2.2 硫酸溶液（0.22 mol/L）：于2000 mL烧杯中加入700 mL水，12.32 mL硫酸，用水稀释至1000 mL。10.2.3 硫酸溶液（0.5 mol/L）：于2000 mL烧杯中加入700 mL水，28 mL硫酸，用水稀释至1000 mL。10.2.4 氢氧化钠溶液（10 mol/L）：准确称取200 g氢氧化钠，加400 mL水溶解后，用水定容至500 mL。10.2.5 氢氧化钠溶液（0.1 mol/L）：准确移取10 mL 10 mol/L氢氧化钠溶液，用水定容至1000 mL。10.2.6 培养基：称取5.3 g吡哆醇Y培养基，溶解于100 mL蒸馏水中。10.2.7 琼脂培养基：称取5.3 g吡哆醇Y培养基，1.2 g琼脂，稀释至100 mL。10.2.8 生理盐水（9 g/L）：准确称取9 g氯化钠，用水溶解后定容至1000 mL。10.2.9 溴甲酚绿溶液（0.4 g/L）：准确称取0.1 g溴甲酚绿于研钵中，加1.4 mL 0.1 mol/L氢氧化钠溶液研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释到250 mL。10.3 标准品盐酸吡哆醇（C8H12ClNO3, CAS: 58-56-0）标准品：纯度99%。10.4 标准溶液配制10.4.1 吡哆醇标准储备液（100 g/mL）：准确称取122 mg盐酸吡哆醇标准品，用25%乙醇溶液溶解并定容至1000 mL。保存于4冰箱中，稳定1个月。10.4.2 吡哆醇标准中间液（1 g/mL）：准确吸取1 mL吡哆醇标准储备液，用水稀释并定容至100 mL。10.4.3 吡哆醇标准工作液（50 ng/mL）：准确吸取5 mL吡哆醇标准中间液，用水定容至100 mL。 11 仪器和设备11.1 光栅分光光度计。11.2 天平：感量1 mg和0.1 mg。11.3 电热恒温培养箱。11.4 高压釜。11.5 液体快速混合器。11.6 离心机。12 分析步骤12.1 菌种的制备及保存（避光处理） 12.1.1 以卡尔斯伯酵母菌（Saccharomyces Carlsbergens is ATCC No.9080简称SC）纯菌种接入2个或多个琼脂培养基管中，在300.5 恒温箱中保温1820 h，取出于冰箱中保存，至多不超过两星期。保存数星期以上的菌种，不能立即用作制备接种液之用，一定要在使用前每天移种一次，连续23 d，方可使用，否则生长不好。12.1.2 种子培养液的制备加0.5 mL 50 ng/mL的吡哆醇标准工作液（10.4.3）于尖头管中，加入5.0 mL基本培养基，塞好棉塞，于高压釜121 下消毒10 min，取出，置于冰箱中，此管可保留数星期之久。每次可制备24管。12.2 试样处理（整个步骤需要避光）12.2.1 称取试样0.510.0 g（维生素B6含量不超过10 ng）放入100 mL 三角瓶中，加72 mL 0.22 mol/ L硫酸溶液。放入高压釜121 下水解5 h，取出冷却，用10.0 mol/L氢氧化钠溶液和0.5 mol/L硫酸溶液调pH值至4.5，用溴甲酚绿做指示剂（指示剂由黄-黄绿色），将三角瓶内的溶液转移到100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100 mL，滤纸过滤，保存滤液于冰箱内备用（保存期不超过36 h）。12.2.2 接种液的制备 使用前一天，将卡尔斯伯酵母菌菌种由储备菌种管移种于已消毒的种子培养液中，可同时制备两根管，在300.5 的恒温箱中培养1820 h。取出离心10 min（3000 r/min）倾去上部液体，用已消毒的生理盐水淋洗2次，再加10 mL消毒过的生理盐水，将离心管置于液体快速混合器上混合，使菌种成为混悬体，将此液倒入已消毒的注射器内，立即使用。12.2.3 标准曲线的制备3组试管各加0.00、0.02、0.04、0.08、0.12和0.16 mL吡哆醇工作液，再加5.00 mL吡哆醇Y培养基，混匀，加棉塞。12.2.4 试样管的制备在试管中分别加入0.05、0.10、0.20 mL样液，再加入5.00 mL吡哆醇Y培养基，用棉塞塞住试管，将制备好的标准曲线和试样测定管放入高压釜121 下高压10 min，冷至室温备用。12.2.5 接种和培养 每管种一滴接种液，于300.5 恒温箱中培养1822 h。12.3 测定将培养后的标准管和试样管从恒温箱中取出后，用分光光度计于550 nm波长下，以标准管的零管调零，测定各管的吸光度值。以标准管维生素B6所含的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制维生素B6标准工作曲线，用试样管得到的吸光度值，在标准曲线上查到试样管维生素B6的含量。13 分析结果的表述试样提取液中维生素B6的浓度按公式（3）计算： （3）式中：c 试样提取液中维生素B6的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；u 各试样测定管中维生素B6的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）。试样提取液中维生素B6的含量按公式（4）计算： （4） 式中：X 试样中维生素B6（以吡哆醇计）的含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；c 试样提取液中维生素B6的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V 试样提取液的定容体积与稀释体积总和，单位为毫升（mL）；m 试样质量，单位为克（g）；100/106 折算成每100 g试样中维生素B6的毫克数。计算结果表示到小数点后两位。14 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。15 其他方法检出限为0.1 ng，线性范围为0.1 ng6 ng。附录A维生素B6各组分标准溶液的浓度校正方法分别准确吸取1.00 mL吡哆醇、吡哆醛、吡多胺标准储备液，用0.1 mol/L盐酸溶液定容到100 mL，作为标准测试液。以0.1 mol/L盐酸溶液作为对照溶液。