生物工程教案及讲稿

1 生物工程生物工程 教案及讲稿教案及讲稿 课程名称生物工程 总学时数36理论学时27实验学时9学 分 学科基础课 专业核心课 注 在选中的括号中打钩即可课程 类型专业选修课 公共基础课 注 在选中的括号中打钩即可 考核方式 考试 考查 注 在选中的括号中打钩即可 是否采用多媒体采用是否采用双语教学否 教材名称 生物工程概论 第二版 教材作者利容千 所 用 教 材 出版社及 出版时间 华中师范大学出版社 2007 名称作者 出版社及出版时间 生物工程概论 陶兴无化学工业出版社 2005 现代生物工程导论 贺小贤科学出版社 2005 生物工程导论 岑沛霖化学工业出版社 2004 参 考 书 目 2 第 1 讲第 1 次课 2 课时 章 节名称第一章 绪论 教学目的 与教学要求 本章从生物技术的定义 发展历史 现代生物工程的基本内容 当代生物技术的应用 概况等方面 深入浅出地介绍了生物工程的基础知识 使学生对近代及当代的生物技 术发展有所了解 提高他们刻苦学习专业知识 完善自己的知识结构 为建设祖国而 奋斗的自觉性和积极性 教学重 难点 教学重点 生物技术和生物工程 生物工程和其他学科的关系 生物工程的基本 内容 生物工程在各行各业的应用 教学难点 现代生物技术带来的问题 教 学 方 法 讲授加板书 多媒体教学 教教 学学 内内 容容 第一章 绪论 一 生物技术的概述 二 生物工程的内容 三 现代生物技术的应用和研究热点 四 现代生物技术带来的问题 同学们大家好 大家都知道每次社会经济的飞跃都伴随着某种革命 第一次工业 革命发明了什么 蒸汽机和纺纱机 解放了人的双手 第二次技术革命是什么 信息技术 扩展了人的大脑 那么我们现在的社会正在发生新的变革 随着人类 对自身和生物的了解日益加深 改造自身和获得新生物的愿望也越来越迫切 也就 有了第三次技术革命 生物技术 生物技术将是未来经济发展的新动力 为什么这么说 当今人类社会面临最重大的问题和挑战 人口膨胀 粮食短缺 疾病危害 环境污染 能源危机 资源匮乏 生态平衡破坏 生物物种大量消亡 解决人类生存与发展所面临的一系列重大问题 在很大程度上将依赖于生命科学的 发展 生命科学对人类经济 科技 政治和社会发展的作用是全方位的 一 什么是生物技术 1982 年 国际合作与发展组织 ICDO 对生物技术进行了定义 即应用自然科学 及工程学原理 依靠微生物 动物体 植物体作为生物发应器 将原料加工以提供 产品来为社会服务的技术 美国政府技术顾问委员会 OAT 的定义 应用生物或来自生物体的物质制造或 改进一种商品的技术 其还包括改良有重要经济价值的植物与动物和利用微生物改 良环境的技术 1 定义 是以现代生命科学理论为基础 利用生物体及其细胞的 亚细胞的和 分子的组成部分 结合工程学 信息学等手段开展研究及制造产品 或改造动物 3 植物 微生物等 并使其具有所期望的品质 特性 从而为社会提供商品和服务的 综合性技术体系 生物工程定义 以现代生命科学为基础 把生物体系与工程学技术有机结合在 一起 按照预先的设计 定向地在不同水平上改造生物遗传性状或加工生物原料 产生对人类有用的新产品 或达到某种目的 之综合性科学技术 特征 21 世纪最具潜力的高新技术 多学科 交叉 综合的技术 影响最为深远最广泛的技术 2 分类 1 传统生物技术 传统生物技术主要是指通过微生物的初级发酵来生产产品的技术 如酱油 酒 面包 酸奶及其它发酵食品的传统工艺 它包括三个重要的步骤 第一步 上游处理过程 所谓上游过程 是指对于粗材料进行加工 作为 微生物的营养和能量来源 第二步 发酵和转化 发酵指的是目的微生物的大量生长发酵过程必须在 一个大的生物反应器内进行 反应器容积通常大于 lOO L 可以连续生产某一个目 的产品 第三步 下游处理过程 主要是指所需目的产物的纯化过程 人们既可以 从细胞的培养液中纯化 也可以直接从细胞中纯化 纯化方法包括蒸馏 萃取 结 晶 干燥 过滤等 2 现代生物技术 现代生物技术是在 20 世纪 70 年代于细胞遗传学和分子 生物学基础上发展起来的以基因工程 细胞工程 发酵工程 酶工程 蛋白质工程 等为主要研究内容的技术体系 在现代高新技术领域中 它与信息技术 新材料科学并列为当今三大前沿 科学 并且占据着更重要的地位 3 生物技术与生物工程的关系 生命科学原理生命科学原理 生物化学 微生物学 细胞生物学 分子遗传学 工程技术工程技术生物工程生物工程 物理 化学工程 数学 计算机技 术 信息学等 物理 化学工程 数学 计算机技 术 信息学等 生物技术的大 规模产业化 生物技术的大 规模产业化 生物技术与生物工程的关系生物技术与生物工程的关系 生物技术和生 物工程的区 别 生物技术和生 物工程的区 别 4 二二 生物工程的内容 1 基因工程 基因工程是指在微观领域 分子水平 中 根据分子生物学和遗传 学原理 设计并实施一项把一个生物体中有用的目的 DNA 遗传信息 转入另一个生 物体中 使后者获得新的需要的遗传性状或表达所需要的产物 最终实现该技术的 商业价值 基因工程技术及其应用 供体细胞 目的基因 载体 重组DNA分子 转化细胞 受体细胞 多肽药物 疫苗 抗体 基因治疗 基因诊断 转基因动物 畜牧业 渔业 生物反应器 转基因植物 农业 林业 生物反应器 冶金 环保 轻工 食品 2 蛋白质工程 后基因组时代 将是 蛋白质组学时代 即从对基因信息的研究转向对蛋白 质信息的研究 包括研究蛋白质结构 功能与应用及蛋白质相互关系和作用 蛋白质工程就是在对蛋白质的化学 晶体学 动力学等结构与功能认识的基础上 对蛋白质人工改造与合成 最终获得商业化的产品 3 酶工程 是酶学与工程学的相互渗透和结合所发展起来以酶为研究对象 改造并应用酶的 特异催化功能 目标就是通过工程化技术大规模生产和转化相应原料成为有用物质 的技术 传统的酶工程主要是指天然酶制剂在工业上的大规模生产与应用 随着科学的发 展 尤其是基因工程技术的日趋完善 为酶工程赋予了新的内容 特别是利用 DNA 操作技术 修饰改造酶分子的结构或活性位点 酶与底物作用位点 重组酶的生产 模拟酶的人工设计与合成等成为新的内容 4 细胞工程 利用工程学原理进行细胞生物学的基础研究和制造使用活细胞的产品 如组织工 程和生物加工工程 前者是利用移植的细胞 骨架 DNA 蛋白质或蛋白质片段替 代或修复已受伤或损坏的组织和器官 后者是 利用活细胞生产生物医药产品 5 发酵工程 现代发酵工程主要指利用微生物 包括利用 DNA 重组技术改造的微生物在全 5 自动发酵罐或生物反应器中生产某种商品的技术 现代发酵工程是生物代谢 微生物生长动力学 大型发酵罐或生物反应器研制 化工原理等密切结合和应用的结果 基因工程是核心 带动其他四大工程的发展 四大工程的发展又促使基因工程 发展更迅猛 基因工程和细胞工程看作生物工程的上游处理技术 将发酵工程和酶 工程看作生物工程的下游处理技术 基因工程 细胞工程和发酵工程中所需的酶往 往是通过酶工程来获得的 三 现代生物技术的应用和研究热点 1 医药 生物制药 基因治疗 人工器官 2 农业和畜牧业 转基因植物 抗病虫害新品种 抗逆新品种 高品质新品种 转基因动物 生产有用蛋白质和高品质的畜产品 生物反应器 利用动植物细胞或组织作为生物反应器 直接生产有用蛋白质 3 轻工与食品 新型食品 营养食品 保健食品 轻工用酶 4 环境 污染治理 废物利用 污染物生物降解 5 特点 八高一低 四现代生物技术带来的问题 1 经过基因改造的生物或生物产品是否会对其他生物体和环境造成危害 2 开发和使用基因工程药物是否会降低自然界的生物多样性 3 人是否也可以成为基因工程操作的对象 4 基因诊断的程序是否会侵犯个人隐私权 5 用现代生物技术生产的药物进行治疗是否会压抑同样有效的传统治疗方式 6 农业生物技术是否会彻底改变传统的耕作方式 7 现代生物技术专利的申请是否会阻止科学家之间自由的学术思想交流 影响宗 教和文化 6 8 现代生物技术能否有效对付严重危害和威胁人类健康与生命安全的传染性疾病 作业 讨论题 思考题 什么叫做生物工程 按照研究对象 生物工程包括哪些方面 7 第 2 讲第 2 次课 2 课时 章 节名称第二章 基因工程 教学目的 与教学要求 熟悉基因的基本概念 性质 掌握基因的功能 了解基因工程的诞生背景 教学重 难点 教学重点 基因的结构 功能 DNA 双链的性质 遗传信息的传递法则 教学难点 导致基因工程诞生理论上的三大发现和技术上的三大突破 教 学 方 法 讲授加板书 多媒体教学 教教 学学 内内 容容 第二章 基因工程 第一节 基因的基本概念 一 什么是基因 二 基因的结构 三 基因的功能 第二节 基因工程的概述 一 基因工程的诞生 上节课过渡到本次课的内容 一 什么是基因 基因 Gene Mendelian factor 是指携带有遗传信息的 DNA 或 RNA 序列 也称 为遗传因子 是控制性状的基本遗传单位 基因通过指导蛋白质的合成来表达自己 所携带的遗传信息 从而控制生物个体的性状表现 孟德尔发现了遗传因子 1 生物性状的遗传由遗传因子决定 遗传因子后来被称为基因 2 遗传因子在体细胞内成对存在 其中一个成员来自父本 另一个成员来自母 本 3 遗传因子符合自由组合规律 二 基因的结构 复习 1 核酸的化学组成 包括 DNA 的化学组成 脱氧核苷酸的分类 2 DNA 的分子结构 3 基因的结构 1 基因的三个特性 基因可以自我复制 基因决定性状 8 基因可以突变 2 分类 结构基因 一条基因决定一条多肽链 调控基因 调节控制结构基因表达 原原核核细细胞胞的的基基因因结结构构原原核核细细胞胞的的基基因因结结构构 编编码码区区编编码码区区非非编编码码区区 非非编编码码区区非非编编码码区区非非编编码码区区 编编码码区区上上游游编编码码区区上上游游编编码码区区下下游游 编编码码区区下下游游 调调控控遗遗传传信信息息的的表表达达调调控控遗遗传传信信息息的的表表达达 调调控控序序列列调调控控序序列列 编编码码蛋蛋白白质质编编码码蛋蛋白白质质 编编码码序序列列编编码码序序列列 真真核核细细胞胞的的基基因因结结构构真真核核细细胞胞的的基基因因结结构构 编编码码区区编编码码区区非非编编码码区区 非非编编码码区区非非编编码码区区非非编编码码区区 编编码码区区下下游游编编码码区区下下游游 调调控控遗遗传传信信息息的的表表达达调调控控遗遗传传信信息息的的表表达达 调调控控序序列列调调控控序序列列 外外显显子子外外显显子子 能能编编码码蛋蛋白白质质能能编编码码蛋蛋白白质质 内内含含子子内内含含子子 不不能能编编码码蛋蛋白白质质不不能能编编码码蛋蛋白白质质 三 基因的功能 1 携带遗传信息 从遗传学上来说 基因代表一个遗传单位 一个功能单位 一 个突变单位 9 2 基因的复制 D DN NA A的的复复制制 边边解解旋旋边边复复制制 半半保保留留复复制制 遵遵循循碱碱基基互互补补配配对对原原 则则 双双向向复复制制 3 基因的表达 基基因因对对性性状状的的控控制制 1 1 通通过过控控制制蛋蛋白白质质分分子子的的结结构构来来影影响响性性状状 2 2 通通过过控控制制酶酶的的合合成成来来控控制制代代谢谢过过程程 从从 而而控控制制生生物物性性状状 蛋蛋白白质质D DN NA Am mR RN NA A 基基因因的的表表达达基基因因的的表表达达 分分子子遗遗传传的的中中心心法法则则分分子子遗遗传传的的中中心心法法则则 转转录录转转录录 表表达达表表达达 由 DNA 控制的蛋白质合成涉及两个基本过程 第一步 DNA 的遗传信息转录到 mRNA 中 发生在细胞核中 第二步 将 mRNA 的信息翻译成蛋白质的氨基酸序列 在细胞质中进行 原核生物中遗传信息的转录和翻译则简单一些 简单回顾下原核和真核生物基因转录翻译的不同 10 第二节 基因工程的概述 一 基因工程的诞生 导致基因工程诞生的是分子生物学领域的理论上的三大发现和技术上的三大发明 理论上的三大发现 基因的物质基础是 DNA DNA 的双螺旋结构和半保留复制 遗传密码子的破译 技术上的三大发明 工具酶的发明 载体 逆转录酶 有了这些理论核技术的武装 基因工程的临盆降生指日可待 Berg 和 Cohen 两 位科学的 助产士 把基因工程接到了人间 我们应该记住他们 1 第一个实现 DNA 重组的人 Berg 1972 年 Berg 用 E coR 切割 SV40DNA 和 phageDNA 经过连接组成重 组的 DNA 分子 Berg 是第一个实现 DNA 重组的人 2 第一个取得基因工程成功的人 Cohen 1973 年 Cohen Group 将 E coli 的 tetr 质粒 psclol 和 nersrR6 3 质粒体外限制 酶切割 连接成一个新的质粒 转化 E coli 在含四环素和新霉素的平板上筛选出了 terrNer 实现了细菌遗传性状的转移 这是基因工程史上的第一个克隆化并取得成功 的例子 这一年被定为基因工程诞生的元年 作业 讨论题 思考题 基因工程诞生时理论上的三大发现和技术上的三大突破是什么 11 第 3 讲第 3 次课 2 课时 章 节名称第二章 基因工程 教学目的 与教学要求 了解基因工程的概念 特点和意义 熟悉基因工程的步骤 掌握 PCR 法和限制性内 切酶的特点 教学重 难点 教学重点 基因工程的本质 特点 基因工程的步骤 目的基因的获取方法 基 因工程中主要的工具酶 教学难点 基因工程的操作步骤 目的基因的合成 如 PCR 法 工具酶的功能 和应用 教 学 方 法 讲授加板书 多媒体教学 放视频 教教 学学 内内 容容 第二节 基因工程的概述 二基因工程的概念 三基因工程的特点和意义 第三节基因工程的操作 一 基因工程的步骤 二 目的基因的分离和合成 三 基因工程工具酶 二 基因工程的概念 基因工程 在生物体外 通过对 DNA 分子进行人工 剪切 和 拼接 对生物 的基因进行改造和重新组合 然后导入受体细胞进行无性繁殖 使重组基因在受体 细胞内表达 产生出所需要的基因产物 基因工程的别名基因拼接技术或 DNA 重组技术 操作环境生物体外 操作对象基 因 操作水平DNA 分子水平 基本过程剪切 拼接 导入 表达 结果人类需要的基因产物 实质基因重组 12 三 基因工程的特点和意义 1 特点 跨物种性 外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖 如人的胰岛素基因可 以转移到大肠杆菌上表达 无性扩增 外源 DNA 在寄主细胞内可大量扩增 和高水平表达 2 意义 基因工程是按照人的意志定向培育生物新品种 新类型乃至创造自然界从 未有过的新生物的最佳途径 基因工程是现代新技术革命的标志 第三节 基因工程的操作 一 基因工程的步骤 在体外通过人工剪 接 将不同来源的 DNA 分子组成一个杂合 DNA 分子 DNA 分子重组体 然后导入宿主细胞去复制扩增或表达 因为通过人工设计 得到一定 的设计方案 故称为基因工程 由于整个操作在分子水平上进行 所以也称分子克 隆 基因工程的基本特点是 分子水平操作 细胞水平表达 四个基本条件 目的基因 工具酶 载体 受体细胞 五五个个基基本本步步骤骤 五五个个基基本本步步骤骤 1 1 提提取取提提取取目目的的基基因因目目的的基基因因 2 2 获获取取获获取取基基因因载载体体基基因因载载体体 3 3 目目的的基基因因目目的的基基因因与与运运载载体体结结合合与与运运载载体体结结合合 4 4 将将目目的的基基因因将将目目的的基基因因导导入入导导入入受受体体细细胞胞受受体体细细胞胞 5 5 目目的的基基因因的的目目的的基基因因的的检检测测检检测测和和和和表表达达表表达达 一一 基基因因工工程程的的步步骤骤 具 具 具 具 酶酶具 具 具 具 酶酶 二 目的基因的分离与合成 1 提取目的基因的方法 一 直接分离基因 鸟枪法 将供体生物的 DNA 用限制酶切割为许多片段 再用运载体将这些片段都运载到受 体生物的不同细胞中去 只要有一个细胞获得了需要的目的基因并得以表达 基因 工程就算成功了 该法最大的缺点是带有很大的盲目性 工作量大 成功率低 且 不能将真核生物的基因转移到原核生物中去 2 提取目的基因的方法 二 反转录法 以目的基因转录成的信使 RNA 为模板 反转录成互补的单链 DNA 然后在酶的作 用下合成双链 DNA 从而获得所需的基因 13 3 提取目的基因的方法 三 根据已知蛋白质的氨基酸序列 推测出相应的信使 RNA 序列 然后按照碱基互补 配对原则 推测出它的结构基因的核苷酸序列 再通过化学方法 以单核苷酸为原 料合成目的基因 优点缺点 鸟枪法操作简便广泛使用 工作量大 盲目 分离出来的有时并非 一个基因 反转录法专一性强 操作过程麻烦 mRNA 很不稳定 要求的 技术条件较高 根据已知氨基酸 合成 DNA 法 专一性最强仅限于合成核苷酸对较少的简单基因 4 人工合成 PCR 技术原理及反应过程 原理 DNA 双链复制 反应过程 加热至 90 95 目的基因 DNA 解链 冷却至 55 60 引物结合到互补 DNA 链 加热至 70 75 热稳定 DNA 聚合酶从引物起始互补链的合成 三 基因工程工具酶 哪些新技术能哪些新技术能 大大简化基因大大简化基因 工程的操作技工程的操作技 术 术 1 DNA 序列序列 自动测序仪自动测序仪 2 PCR 技术技术 14 1 基因的剪刀 限制性内切酶 简称限制酶 限制酶是在生物体 主要是微生物 内的一种酶 能将外来的 DNA 切断 由于这种 切割作用是在 DNA 分子内部进行的 故名限制性内切酶 特点 特异性 即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 并且能在特定的 切点上切割 DNA 分子 意义不大非常有用无用 在基因工 程中意义 相距5 10bp同一位点 分别 随机切 割 相距较远 识别与切 割位点 双功能单一功能单一功能 限制和修 饰活性 型 型 型特性 限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶的的分分类类 限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶的的分分类类限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶的的分分类类 限制酶的识别位点 一般特征 4 点 1 型酶识别的特殊 DNA 序列称为限制酶的识别位点 或切割位点 2 它能识别 dsDNA 的 4 6bp 碱基对 的回文序列并水解该部分的核苷键 一般来说是 4 6bp 有 6 个以上的 但没有 4 个以下的 3 识别顺序呈二重对称 回文结构 即 180 度旋转对称 如 GC CG GTNAC GAA TTC Hha CG GC Mae CANTG EcoR CTT AAG 4 特异性 限制酶的切割位点 限制性对 dsDNA 2 条链同时切割 其具体切割点 即磷酸二酯键断开的位点 相对二重对称轴的位置而异 产生 3 种不同切口 1 形成平头末端 flush 或 bluntend 如 TC GA sma bsuR or TC3 5 GA AG CT Alu AG5 3 CT 2 形成 5 粘性末端 5 cohesive end 即 3 延伸末端 5 GAATTC3 EcoR 5 G AATTC 3 3 CTTAAG5 3 CTTAA G 5 3 形成 3 粘性末端 3 cohesive end 思考 基因工思考 基因工 程培育抗虫棉程培育抗虫棉 的简要过程 的简要过程 上述培育抗虫上述培育抗虫 棉的关键步骤棉的关键步骤 是什么 是什么 15 5 CTGCAG 3 pst G 3 5 CTGCA 3 GACGTC 5 ACGTC 5 3 G 粘性末端 sticky end 被限制酶切开的 DNA 两条单链的切口 带有几个伸 出的核苷酸 他们之间正好互补配对 这样的切口叫黏性末端 2 基因的针线 DNA 连接酶 DNA 连接酶可把黏性末端之间的缝隙 缝合 起来 即把梯子两边扶手的断口 连接起来 这样一个重组的 DNA 分子就形成了 DNA 连接酶是 1967 年在三个实验 室同时发现的 最初是在大肠杆菌细胞中发现的 它是一种封闭 DNA 链上缺口酶 借助 ATP 或 NAD 水解提供的能量催化 DNA 链的 5 PO4与另一 DNA 链的 3 OH 生 成磷酸二酯键 但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的 T4DNA 连接酶除外 而且必须是两条紧邻 DNA 链才能被 DNA 连接酶催化成磷酸二酯键 3 其他工具酶 Taq DNA 聚合酶 75 80 主要用于 PCR 扩增及 DNA 序列测定 逆转录酶 mRNA cDNA 主要用于组建 DNA 文库 T4多核苷酸酶主要用于制备杂交探针及测序引物的 5 磷酸标记 作业 讨论题 思考题 1 简述限制性内切酶和 DNA 连接酶的作用机制 2 如何采用 PCR 技术从生物材料中分离出目的基因 16 第 4 讲第 4 次课 2 课时 章 节名称第二章 基因工程 教学目的 与教学要求 掌握基因工程的载体的类型 功用和构建 熟悉基因导入受体细胞的方法 了解基因 工程的应用和发展 教学重 难点 教学重点 载体应具备的条件 质粒载体和噬菌体载体的特点 目的基因导入细 胞的方法 教学难点 结合理论了解基因工程的应用 教 学 方 法 讲授加板书 多媒体教学 教教 学学 内内 容容 第三节 基因工程的操作 四 基因工程载体 五 目的基因导入受体细胞 第四节 基因工程的应用和发展 四 基因工程载体 1 定义 将外源 DNA 或基因携带入宿主细胞的工具称为载体 简言之 就是基 因的运载工具 功能 运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 载体应具备的条件 1 在宿主细胞内必须能够自主复制 具备复制原点 2 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 供外源 DNA 片断插入 同时不 影响复制 3 有一定的选择标记 用于筛选 4 具有较高的拷贝数 便于载体的制备 目前常用的载体有质粒载体 plasmid 噬菌体载体和病毒载体 2 质粒 是染色体外能够进行自主复制的遗传单位 包括真核生物的细胞器和细 菌细胞中核区外的 DNA 分子 现在习惯上用来专指细菌 酵母菌和放线菌等生物中 核以外的 DNA 分子 质粒是基因工程最常用的运载体 绝大多数细菌质粒都是闭合环状 DNA 分子 有的一个细菌中有一个 有的一 个细菌中有多个 最常用的质粒是大肠杆菌的质粒 其中常含有抗药基因 如四环素的标记基因 质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用 但复制只能在宿主细胞内成 通过重组克隆的 插入失活 来进行筛选 17 pBR322 插入在 Tetr 中 基因型为 Tets Ampr 在含有氨卞青霉素培养基 上可生长 在含有四环素培养基上不生长 pBR322 插入在 Ampr 中 基因型为 Tetr Amps 在含有氨卞青霉素培 养基上不生长 在含有四环素培养基可生长 而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型 这种在一个基因位点中插入外源 DNA 片段 从而使该基因活性丧失的现象叫插 入失活 3 噬菌体载体 1 线状双链 DNA 分子 全长 48 502kb 2 两端的 5 末端具有 12 碱基的突出互补的粘性末端 cohensive end cos 该末端称为 cos 位点 可被 编码的 A 蛋白所识别 3 当 侵入宿主细胞后 线状 DNA 分子借助粘性末端连接成环状分子 噬菌体的改造噬菌体的改造 切去非必须区段 在切去的同时 加载目的基因 2 5kb 或更大 去掉太多的酶位点 每种酶只留 1 2 个切口 增加标记基因 4 引入无义突变 4 人工染色体克隆载体 人工染色体载体又叫大分子 DNA 克隆载体 利用染色体的复制元件来驱动外源 DNA 片段复制的载体 其装载外源 DNA 片段的容量可以与染色体的大小媲美 用来克隆大片段的 DNA 不做常规克隆使用 五 目的基因导入受体细胞 1 常用的受体细胞 有大肠杆菌 枯草杆菌 土壤农杆菌 酵母菌和动植物细胞等 2 转化途径 转化法 1 将细菌用 CaCl2 处理 以增大细菌细胞壁的通透性 2 使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞 3 目的基因在受体细胞内 随其繁殖而复制 由于细菌繁殖的速度非常 快 在很短的时间内就能获得大量的目的基因 基因枪法 将待转化的 DNA 沉淀在细小金属珠的表面 用特制枪将金属珠直接 打入动植物细胞 枪的威力为 430 m s 显微注射法 通过激素疗法使雌鼠超数排卵 并与雄性小鼠交配 然后杀死雌鼠 从其输卵 管内取出受精卵 借助于显微镜将纯化的 DNA 溶液迅速注入到受精卵中变大了的雄 性原核内 上述程序多用于动物个体的转基因过程 由于必须单细胞逐一操作 所 以不太适用于基因的克隆和表达 花粉管导入法 将外源 DNA 沿着花粉管经过珠心进入尚未形成正常细胞壁的卵 合子或早期胚胎细胞中 从而实现基因的转移 这一方法是我国科学家周光宇首先 提出设计的 目前已应用于水稻 小麦 棉花 大豆 花生 蔬菜等作物的转基因 研究 花粉管导入法的特点是直接 简便 它的受体材料为植株整体 省略了细胞 组织培养的诱导和传代过程 排除了植株再生的障碍 特别适合于难以建立有效再 生系统的植物 由于转化的是完整植株的卵细胞 受精卵或早期胚胎细胞 导入的 DNA 分子整合效率较高 18 第四节 基因工程的应用和发展 一 基因工程在农业生产中的应用 二 基因工程在工业中的应用 三 基因工程在医药上的应用 四 基因工程在环境保护中的应用 五 基因工程技术的商业化发展 作业 讨论题 思考题 1 基因克隆载体至少应具备哪些特点 2 选择受体细胞重点考虑哪几点 3 简述外援基因转入受体细胞的各种途径 19 第 5 讲第 5 次课 2 课时 章 节名称第三章 发酵工程 教学目的 与教学要求 掌握什么是发酵的基本概念 熟悉发酵过程 了解发酵工程的发展史 教学重 难点 教学重点 什么是发酵 发酵的工业过程 教学难点 现代生物技术带来的问题 教 学 方 法 讲授加板书 多媒体教学 教教 学学 内内 容容 第一节 发酵工程概述 一 发酵工程的定义 二 发酵工程的应用范围 三 微生物发酵技术的发展历史 四 发酵过程的组成部分 第二节 发酵设备与基本工艺过程 一 发酵设备 二 发酵工程基本工艺 一 菌种的选育 二 培养基的配制 从上节课内容引到本节课 第一节 发酵工程概述 一 发酵工程的定义 一 什么是发酵 1 传统意义的发酵 发酵 Fermentation 一词是拉丁语 沸腾 fervere 的派生词 它描述酵母作用于果汁或麦芽浸出液时产生气泡的现象 或者是指酒的生产过程 酵母无氧条件下的呼吸过程 产生气泡的现象是由浸出液中的糖在缺氧条件下降解 而产生的二氧化碳所引起的 2 生化和生理学意义的发酵 指微生物在无氧条件下 分解各种有机物质产生能量的一种方式 或者更严格地说 发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应 指葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出 CO2 3 工业上的发酵 现代意义上的发酵 泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程 20 厌氧培养的生产过程 酒精 乳酸等 通气 有氧 培养的生产过程 抗生素 氨基酸 酶制剂等 产品有细胞代谢产物 也包括菌体细胞 酶等 二 发酵工程的定义 利用微生物的特定性状和机能 通过现代化工程技术 生产有用物质或直接应用于 工业化生产的一种技术体系 是将传统的发酵技术与现代的基因工程 细胞工程 代谢工程 生物信息工程和计算机控制等新技术结合并迅速发展的现代发酵技术 三 发酵工程的特点 1 原料特点 广泛 粗放 经济 2 微生物细胞特点 1 细胞工厂 可从单一发酵设备中一次合成 2 代谢复杂性 所需产品无论多么复杂 可合成复杂产物 3 酶促反应的高选择性 手性转化 附加值高 具有重大经济价值的物质 4 生物多样性 微生物种类多 微生物的特定性状和性能 通过传统和现代 技术发现 调控某一特性 3 与化学工程相比 1 发酵过程常温常压下 一般不用考虑防暴问题 2 发酵过程是纯培养过程 防止杂菌污染 生产过程所需的设备 培养基和空气 都需进 行严格的无菌处理 一旦杂菌侵入就有可能导致发酵生产的失败 3 微生物发酵液成分较复杂 其产品分离与纯化过程比化学反应过程复杂得多 4 微生物菌体也是发酵产物 微生物细胞富含蛋白质 核酸 维生素等有用物质 微生物发酵液一般不含对生物提有害的物质 4 与其他学科的关系 二二 发酵工程的应用范围发酵工程的应用范围 1 以微生物细胞为产物的发酵工业 生产制作面包的酵母菌 生产作为人类或动物食物的微生物细胞 即单细胞蛋 21 白质 2 以微生物代谢产物为产品的发酵工业 当微生物进入稳定期后 代谢产生如氨基酸 核苷酸 脂类和碳水化物以及抗生 素等多种初级和次级代谢产物 3 生物转化或修饰化合物的发酵工业 生物细胞或其产生的酶能将一种化合物转化成化学结构相似 但在经济上更有价 值的化合物 转化反应包括催化脱氢 氧化 羟化 缩合 脱羧 氨化 脱氨化等 作用 4 微生物废水处理和其他 三三 微生物发酵技术的发展历史微生物发酵技术的发展历史 1 传统 古老 发酵技术 只知其然不知其所以然的经验活动 原始人类 古埃及人在公元前 40 世纪时开始用经发酵的面团制作面包 公元前 40 世纪已 掌握了用裸麦制作啤酒的技术 公元前 25 世纪古巴尔干人开始制作酸奶 公元前 20 世纪古亚述人已学会葡萄酿酒 公元前 17 世纪古西班牙人曾用类似目前细菌浸取铜矿的方法获取铜 我国传统发酵的历史同样悠久 用黏高粱 秫 造酒始于第一个奴隶制朝代 夏 代的初期 迄今约 4000 年 2 近代发酵技术的建立 纯培养技术的建立 微生物纯培养技术的建立 开创了人为控制微生物的时代 密闭式发酵罐人工 控制环境条件的发酵系统 逐渐建立了丙酮 丁醇 甘油 酒精 有机酸 固体酶 制剂等工业 至 20 世纪 20 年代 近代发酵工业已基本形成 在近代发酵工业中 主要的发酵产品为饮料酒 有机溶剂和多元醇等厌氧发酵 产品 有机酸 粗酶制剂 包括中国的酒曲 等好氧微生物的发酵培养则主要采用 固态培养法和表面培养法 3 发酵工业第二个转折期 通风搅拌技术 4 发酵工业第三个转折期 人工诱变育种与代谢控制技术 5 发酵工业第四个转折期 基因工程技术 四四 发酵过程的组成部分发酵过程的组成部分 典型的发酵生产过程包括 确定菌种繁殖和发酵生产所用的培养基 对培养基 发酵罐及其附属设备进行灭菌 菌种经逐级扩大培养后 作为生产种子接种于发酵罐中 控制发酵罐中微生物的生长条件 最大程度地获得预期的代谢产物 产物萃取和精制 发酵过程中废弃物的处理与回收 第二节第二节 发酵设备与基本工艺过程发酵设备与基本工艺过程 一一 发酵设备发酵设备 发酵罐是供微生物在灭菌后的培养基中进行生命活动和代谢的设备 它必须能够 提供微生物生命活动和代谢所要求的条件 并便于操作和控制 保证工艺条件的实 现 从而获得高产 22 二 基本工艺 一 菌种的选育 要想通过发酵工程获得在种类 产量和质量等方面符合人们要求的产品 最重要 的是要有优良的菌种 1 工业上常见的菌种 从自然界中分离出来就能被利用 对野生菌株进行人工诱变 得到突变株才能被利用 使用重组 DNA 技术改造的菌株 目前育种总趋势 从野生菌转向变异菌 自然选育转向代谢育种 从诱发基因突变转向基因重组的定向育种 2 菌种的选育 工业生产中微生物育种的基本方法包括自然选育 诱变育种 抗性菌种选育 代谢控制育种及基因重组定向育种等 育种就是要改善菌种的特性 使之能提高产量 改进质量 降低成本 改进工 艺 方便管理及综合利用等 代谢控制育种主要有两个方面 改变代谢通路的育种 改变代谢自动调节系统的育种 A 自然选育 B 诱变育种 二 培养基的配制 1 培养基的营养成分 1 能源 2 碳源 3 氮源 4 无机盐 5 特殊生长因子 2 培养基的用途 筛选菌种 保藏菌种 检验杂菌 培养种子 发酵生产 3 培养基的分类 1 按培养基组成物质的化学成分 合成培养基 天然培养基 2 按物理性质 固体 液体 3 按用途 选择性培养基 鉴别培养基 富集培养基等 4 发酵生产中的培养基类型 工业发酵中培养基往往是依据生产流程和作用分为 斜面培养基 种子培养基 发酵培养基 摇瓶培养基 5 培养基的选择 1 必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分 2 有利于减少培养基原料的单耗 即提高单位营养物质所合成产物数量或最大 23 产率 3 有利于提高培养基和产物的浓度 以提高单位容积发酵罐的生产能力 4 有利于提高产物的合成速度 缩短发酵周期 5 尽量减少副产物的形成 便于产物的分离纯化 6 原料价格低廉 质量稳定 取材容易 7 所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响 利于提高氧的利用率 降低能耗 8 有利于产品的分离纯化 并尽可能减少产生 三废 的物质 6 培养基的配制 1 首先必须做好调查研究工作 了解菌种的来源 生活习惯 生理生化特性 和一般的营养要求 工业生产主要应用细菌 放线菌 酵母菌和霉菌四大类微生物 它们对营养的要 求既有共性 也有各自的特性 应根据不同类型微生物的生理特性考虑培养基的 组成 2 提供必要的营养成分 培养基成分必须满足细胞生长 代谢活动和合成产 物所需的基本要求 3 配制合适的浓度 可以从发酵动力学有关生长 产物合成和基质利用物料 平衡的关系中大致推算所需原料或大致计算出所需主要原料的需要量 4 主成分与其他成分的配比 5 控制合适的 pH 微生物的生长繁殖或产物的合成往往需要 定的 pH 环境 在最适 pH 值下有利于加快各种酶的反应 因此在整个发酵过程中应使培养基的 pH 适合于微生物生长或产物合成所需 6 注意代谢调节物的影响 有些物质存在于培养基中往往能明显地促进或抑制发酵产物的形成 前体物质 诱导剂 阻遏物 抑制剂 金属离子 7 金属离子的影响 有些种类的发酵生产对金属离子相当敏感 因为有些金属离子是中间代谢酶的抑 制剂或激活剂 因此对于有重大影响的金属离子必须严格控制 如柠檬酸发酵中铁 锰和锌离子 都能明显影响产量 钙离子对细菌淀粉酶的生产有促进作用 而钴离子对葡萄糖 异构酶的发酵是必需的 这些在培养基配制时都必须予以注意 作业 讨论题 思考题 发酵的一般步骤有哪些 24 第 6 讲第 6 次课 2 课时 章 节名称第三章 发酵工程 教学目的 与教学要求 掌握发酵工程的灭菌技术 熟悉发酵过程的操作方式 了解发酵产品的分离纯化过程 教学重 难点 教学重点 发酵工程的灭菌技术 教学难点 发酵过程的操作方式 教 学 方 法 讲授加板书 多媒体教学 教教 学学 内内 容容 第二节 发酵设备与基本工艺过程 二 发酵工程基本工艺 三 培养基和设备的灭菌 四 扩大培养和接种 五 发酵过程 六 产品的分离提纯 第三节 发酵过程的现状与展望 一 应用现状 二 发酵工程的发展趋势 从上节课引入到本节课内容 三 培养基和设备的灭菌 是指从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养体及其孢子 或从中将其除去 工 业规模的液体培养基灭菌 杀灭杂菌比除去杂菌更为常用 灭菌与消毒的区别 灭菌 用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物 包括营养细胞 细菌 芽孢和孢子 消毒 用物理或化学方法杀死物料 容器 器皿内外的病源微生物 灭菌的目的 在发酵过程中夹杂其它杂菌造成的后果 生产菌和杂菌同时生长 生产菌丧失生产能力 在连续发酵过程中 杂菌的生长速度有时会比生产菌生长得更快 结果使发酵罐中以杂菌为主 杂菌及其产生的物质 使提取精制发生困难 杂菌会降解目的产物 25 杂菌会污染最终产品 杂菌会污染最终产品 发酵时如污染噬菌体 可使生产菌发生溶菌现象 培养基灭菌的要求 1 达到要求的无菌程度 10 3 2 尽量减少营养成分的破坏 在灭菌过程中 培养基组分的破坏 是由两个 基本类型的反应引起的 培养基中不同营养成分间的相互作用 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解 灭菌的方法 1 化学法 化学药品灭菌法 2 物理法 干热灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 1 培养基灭菌 培养基的灭菌有分批法和连续法两种 分批灭菌是将配制好的培养基放入发酵罐中 通入蒸汽 使培养基和所有设备 一起灭菌 这一过程也称为实罐灭菌 连续灭菌是在配制好的培养基向发酵罐输送的同时加热 保温和冷却 完成整 个灭菌过程 连续灭菌时间短 灭菌温度一般高于分批灭菌 所以可减少对营养物 质的破坏 灭菌效果优于分批式 但灭菌设备较复杂 投资大 而且所有设备须事 先进行空罐灭菌 如发酵罐 加热器 维持罐 冷却器等 2 空气灭菌 微生物在好氧性发酵过程中一般是以空气作为氧源 被通入发酵系统 但空气 中含有多种微生物 这些微生物一旦随着空气进入发酵系统 它们也会大量繁殖 不仅消耗大量的营养成分 还可能产生各种各样的代谢产物 影响和破坏发酵的正 常进行 危害极大 因此 空气必须经过除菌后才能通入发酵液 3 发酵罐的灭菌 培养基的灭菌如果是采用连续灭菌法 则发酵罐应在加入灭菌的培养基前先行 单独灭菌 通常是用蒸汽加热发酵罐的夹套或设管并从空气分布管中通入蒸汽 充 满整个容器后 再从徘气管中缓缓排出 容器内的蒸汽压力保持 1 公斤 20 分钟 在保温结束后 关键是随即通入无菌空气 使容器保持正压 防止形成真空而吸入 带菌的空气 4 补料液的灭菌 在发酵过程中 往往要向发酵罐中补入各种不同的料液 这些料液都必需经过 灭菌 灭菌的方法则视料液的性质 体积和补料速率而定 如果补料量较大 而具 有连续性时 则采用连续灭菌较为合适 也有利用过滤法对另补料液进行除菌 补 料液的分批灭菌 通常是向盛有物料的容器中直接通入蒸汽 所有的附属设备和管 道都要经过灭菌 四 扩大培养和接种 1 发酵工业的种子制备 26 作为发酵工业的种子应具备以下条件 菌种细胞的生长活力强 菌种生理 状态稳定 菌种浓度及总量能满足大容量发酵罐接种量的要求 无杂菌污染 菌种适应性强 种子培养是指将冷冻干燥管 沙土管中处于休眠状态的工业菌种接入试管斜面活化 后 再经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种的过程 2 2 扩大培养和接种扩大培养和接种 Q1 如何得到发酵生产所需要的大量菌体来缩短生产周期呢 经过多次的扩大培养 Q2 如何对菌种进行扩大培养呢 扩大培养是将培养到对数期的菌体分开 分头进行培养 以促使菌体数量快速 增加 能在短时间里得到大量的菌体 Q3 扩大培养与发酵生产过程中的培养有何不同呢 扩大培养是为了让菌体在短时期内快速增殖 而发酵过程中的培养是为了获得 代谢产物 目的不同采用的培养条件就有可能不同 例如 在酒精发酵过程中 扩大培养是为了促使酵母菌快速增殖 因此是在有 氧条件下进行 而在发酵产生酒精的过程中则必须在无氧条件下进行以获得大量的 酒精 Q4 有了用于生产的充足的菌体 在接种时要注意什么事项呢 接种过程中要注意防止杂菌污染 在发酵罐冷却后 才可加入菌种 五 发酵过程控制 五 发酵过程控制 Q 将菌体接种到装有培养液的发酵罐中 还需要对发酵过程进行检测和对发酵条 件进行控制 这是为什么呢 发酵产物主要在菌体生长的稳定期产生 因此 要在发酵过程中随时取样检测 培养液中细菌数目 产物浓度以了解发酵进程 及时添加必需的培养基成分来延长 菌体生长稳定期的时间 以得到更多的发酵产物 同时 还应对发酵条件进行严格 控制 1 温度对发酵的影响及其控制 1 影响发酵温度的因素 2 温度对发酵的影响 3 最适温度的选择 2 pH 对发酵的影响及其控制 3 溶解氧对发酵的影响及其控制 4 泡沫对发酵的影响及其控制 六 分离 提纯 六 分离 提纯 菌体本身 如酵母菌和细菌等采用过滤 沉淀等方法将菌体从培养液中分离出来 代谢产物采用蒸馏 萃取 离子交换等方法进行提取 27 从从自自然然界界分分离离的的菌菌种种从从自自然然界界分分离离的的菌菌种种 产产品品 基基因因工工程程基基因因工工程程 诱诱变变育育种种诱诱变变育育种种细细胞胞工工程程细细胞胞工工程程 生生产产用用菌菌种种生生产产用用菌菌种种 扩扩大大培培养养扩扩大大培培养养 原原原原料料料料 微微生生物物菌菌体体微微生生物物菌菌体体代代谢谢产产物物代代谢谢产产物物 分分离离分分离离提提纯纯提提纯纯 发酵罐发酵罐 发酵条件控制发酵条件控制 接接种种接接种种 培培养养基基配配置置培培养养基基配配置置 灭灭菌菌灭灭菌菌 第三节 我国发酵工业的现状和展望 一 应用现状 1 酿酒工业 啤酒 葡萄酒 白酒等 2 食品工业 酱 酱油 醋 腐乳 面包 酸乳等 3 有机溶剂发酵工业 酒精 丙酮 丁醇等 4 抗生素发酵工业 青霉素 链霉素 土霉素等 5 有机酸发酵工业 柠檬酸 葡萄糖酸等 6 酶制剂发酵工业 淀粉酶 蛋白酶等 7 氨基酸发酵工业 谷氨酸 赖氨酸等 8 核苷酸类物质发酵工业 肌苷酸 肌苷等 9 维生素发酵工业 维生素 C 维生素 B 等 10 生理活性物质发酵工业 激素 赤霉素等 11 微生物菌体蛋白发酵工业 酵母 单细胞蛋白等 12 微生物环境净化工业 利用微生物处理废水 污水等 13 生物能工业 沼气 纤维素等天然原料发酵生产酒精 乙烯等 能源物质 14 微生物冶金工业 利用微生物探矿 冶金 石油脱硫等 二二 发酵工程的发展趋势发酵工程的发展趋势 1 利用遗传工程等先进技术 人工选育和改良菌种 使微生物细胞按照人类的需要 合成某些产品 2 采用发酵技术进行高等动植物细胞培养 3 按照微生物生理和代谢特性以及产物的合成途径进行发酵条件调控 4 在工程方面 开发和采用大型节能高效的发酵装置 自动控制将成为发酵生产控 制的主要手段 从而使发酵工业朝着模拟化 自动化 最优化方向发展 5 固定化技术广泛应用 6 将生物技术理论广泛地用于发酵工程 28 作业 讨论题 思考题 1 分批发酵过程中 微生物生长通常要经历哪些时期 2 如何对发酵过程进行控制 3 简述简述影响发酵温度的因素及温度对发酵的影响 29 第 7 讲第 7 次课 2 课时 章 节名称第四章 细胞工程 教学目的 与教学要求 了解与细胞工程相关的重要理论 背景知识和细胞工程学的基础知识 理解细胞工程 的各种技术的基本原理 技术路线和方法 了解重要技术的应用途径和范围 存在的 问题及缺点 各种技术的最新进展和发展前景 教学重 难点 教学重点 细胞的概念 细胞的培养 教学难点 细胞的全能性及其应用 教 学 方 法 讲授加板书 多媒体教学 教教 学学 内内 容容 第一节 细胞的基本概念 一 细胞的基本结构 二 细胞分裂 三 细胞工程概念 第二节 植物细胞工程 一 植物细胞的全能性 二 植物组织培养 三 植物细胞培养 第一节 细胞的基本概念 一 细胞的基本结构 细胞是生物形态结构和生命活动的基本单位 细细胞胞各各种种由由膜膜组组成成的的结结构构上上的的膜膜构构成成了了生生物物的的生生物物膜膜系系统统细细胞胞各各种种由由膜膜组组成成的的结结构构上上的的膜膜构构成成了了生生物物的的生生物物膜膜系系统统 细胞膜的特点 1 细胞膜由流动的双脂层和蛋白质组成 30 2 磷脂分子以疏水性尾部相对 极性头部朝向水相组成生物膜骨架 3 蛋白质或在双脂层表面 或嵌在其内部 或横跨整个双脂层 表现出分