口腔微生物学3牙菌斑-

牙菌斑生物膜 (Dental Plaque Biofilm),口腔疾病研究国家重点实验室口腔生物学教研室 李雨庆,一、牙菌斑的定义（掌握） 二、牙菌斑的分类（了解） 三、牙菌斑的基本结构（掌握） 四、牙菌斑的组成（了解） 五、牙菌斑的形成和发育（掌握） 六、牙菌斑的物质代谢（了解） 七、牙菌斑的致病性（了解）,主 要 内 容,牙菌斑（肉眼）,牙菌斑（LM）,牙菌斑细菌及EPS成分三维重建(CLSM),24h,48h,72h,玻片 树脂 玻璃离子,不同牙科材料表面口腔细菌黏附,FISH技术,一、定 义,1683年 发现牙面沉积物中有微小生物体（Van Leuwenhoek）1890年 首次详细论证了细菌、酸和龋病三者的关系（Willoughby D. Miller ）1897年 首先提出牙菌斑的概念（James Leon Williams）1937年 牙面上的微生物必须依赖于牙面特定的菌斑环境代谢产酸（Forsdick）1963年 牙菌斑是附着在牙面上不易被漱口液清洗掉的软而粘的物质（Dawes）,早期对牙菌斑的认识,牙菌斑 (dental plaque),存在于牙面或牙周袋内的一个细菌生态环境，细菌在其中生长、发育和衰亡，并进行着复杂的物质代谢活动，在一定条件下，细菌及其代谢产物将会对牙齿和牙周组织产生破坏,James Leon Williams (April 18, 1852 February 23, 1932) , American prosthodontist and pioneer dental histologist,各种细菌嵌于来自其自身和/或外界环境的胞外基质内，而在固相界面上结成的有着三维立体结构的微生态环境，牙菌斑就是一种经典的生物膜,JOHN WILLIAM COSTERTON (July 21st, 1934 -May 12th, 2012) “the father of biofilm”,生物膜（biofilm）,牙菌斑生物膜示意图,牙菌斑生物膜是牙面上或牙周袋内的多种菌丛构成的生态系。细菌在内生长、发育和衰亡。其复杂的结构使它能包涵对氧不同敏感性的细菌，这些细菌嵌入在由多糖、蛋白质和矿物质组成的基质中。细菌在其中的代谢活动，影响着细菌与宿主之间或细菌菌属之间的动态平衡,牙菌斑生物膜,节制细菌代谢活性和保护菌丛抵抗口腔苛刻环境，使细菌在不适合的条件中仍能存留。膜内高水平的巯基能中和氧基，保护菌细胞免受氧化损伤。膜内的多聚物基质起约束网络作用，摄取和收藏食物，控制基质成分的移动速度。浓缩从环境中来的营养物质和其它元素，保留一些细胞内遗漏出来的溶解物质（如eDNA）。细菌耐药性,生物膜的作用,二、分 类,龈缘为界: 龈上菌斑龈下菌斑：附着菌斑，非附着菌斑,（一）根据所在部位分类,1龈上菌斑（supragingival plaque） 位于牙颈部龈缘以上牙面上的菌斑。包括窝沟菌斑、光滑面菌斑、邻面菌斑、颈缘菌斑。这种菌斑的结构比较完整，主要细菌是革兰阳性球菌、杆菌。随着菌斑成熟，革兰阴性球菌、杆菌和丝状菌的数量增多。,牙龈萎缩,2龈下菌斑(subgingival plaque) 位于龈缘以下，分布在龈沟或牙周袋内，分为附着龈下菌斑和非附着龈下菌斑。,附着龈下菌斑,非附着龈下菌斑,非附着龈下菌斑 位于附着龈下菌斑的表面，为结构较松散的菌群，直接与龈沟上皮和袋内上皮接触，主要为格兰阴性厌氧菌，还包括许多能动菌和螺旋体, 附着龈下菌斑由龈上菌斑延伸到牙周袋内，附着于牙根面，其结构、成分与龈上菌斑相似，细菌种类增多，主要为格兰阳性球菌及杆菌、丝状菌，还可见少量格兰阴性短杆菌和螺旋体,龈上、龈下菌斑的主要特征特征菌 斑 龈上菌斑 龈下菌斑生长环境 有氧、兼性厌氧 兼性、专性厌氧优势菌 G+需氧菌和兼性菌 G-厌氧菌和能动菌唾液清洁 + -食物摩擦 + -代谢底物 糖 类 血清蛋白、氨基酸、糖宿主防卫机制 唾液Ig 血清Ig,1. 致龋菌斑 与龋病发生有关的牙菌斑，多位于牙齿的咬合面、光滑面、邻面和颈缘。主要的致病产物是各种有机酸，如乳酸。,（二）根据致病作用分类,（1）利用蔗糖的速度快，乳酸产生速度快； （2）产生多糖的速度快，接触蔗糖15分钟内 20%以上转化为细胞内多糖； （3）变链球菌的数量多，而非致龋性菌斑中 血链球菌的数量多；（4）与产碱代谢相关酶（尿素酶、精氨酸脱亚胺酶）的活性较非致龋菌斑低,致龋性菌斑的主要生物学特征:,2. 致牙周病菌斑 指位于龈缘和牙周袋内，与牙周疾病发生有关的菌斑。此类菌斑因所处的生态环境不同，含更多的专性厌氧菌，如螺旋体。主要致病产物是破坏性酶和毒素,专性厌氧,产黑色素,牙周复合体,Socransky et. al. 1998. J Clin Periodontol,Most commonly found in patients with periodontal disease,Found in both healthy patients and in periodontal lesions,三、基本结构,牙菌斑的基本结构（LM）,牙菌斑紧靠牙面的获得性膜，无细菌的均质性结构，HE染色呈红色，厚度一般在1-10 m,（一）基底层,Enamel crystals,Pellicle lipid/protein layers (1-10 m),牙菌斑的主体部分，由粘附在获得性膜上的丝状菌彼此平行排列，且与牙面垂直构成，丝状菌之间有大量球菌、杆菌分布或互相粘附。有时平行排列的丝状菌迫使球菌排成链状，好似栅栏，称为栅栏状结构 (palisade structure)。栅栏状结构是牙菌斑的基本结构，也为牙菌斑深层的细菌获得营养和氧气提供通道。,（二）中间层,栅栏状结构（LM）,菌斑的表层结构比较疏松，细菌组成复杂，变动较大，球菌和丝状菌互相交织，短杆菌穿插其间。“谷穗状”结构(corncob)，以丝状菌为中心，周围有许多革兰氏阳性球菌粘附在其表面。以“谷穗”为中心，周围有长杆菌粘附的“瓶刷样”结构(bristle brush)。,（三）表层,谷穗状结构（SEM）,四、组 成,1. 细菌的种类繁多。2. 不同年龄阶段微生物种类差异较大，组成呈动态变化。3. 致病性菌斑与非致病性菌斑的细菌种类差异不大，功能差异较大。,（一）微生物组成的特点,A spectral fluorescence image of 15 different species of human oral microbes grown in the laboratory and labeled with taxon specific probes in a CLASI-FISH experiment. (Credit: Alex Valm),Neighbor-joining tree for human oral taxa in the phylum Tenericutes and the classes Bacilli and Erysipelotrichia of the phylum Firmicutes,The Human Oral Microbiome. JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Oct. 2010, p. 50025017,世界历史分期,旧石器时代：通过狩猎和采集维持生活，制造简单石器,中石器时代：开始家畜驯养，使用打制石器,新石器时代：产生了农业和畜牧业，磨光石器流行,青铜时代：制造使用青铜器,铁器时代：制造使用铁器,中世纪,近 代,现 代,石器时代,古代,封建社会,碳水化合物大量摄入,工业革命/食物更为精细/糖,LBK/Bell Beaker,Jewbury/St. Helen-on the Wallis/Raunds Furnells,采集自正常人群相同部位的菌斑微生物组成种类差异较大，但代谢功能相似。,Nature. 2012 Jun 13;486(7402):207-14.,牙龈卟啉单胞菌的检出率明显升高开始有变异链球菌检出,古代人口腔微生物的多样性保持相对稳定（p 0.05）,现代人口腔微生物的多样性明显减低,致龋性与非致龋性菌斑的细菌构成致龋性菌斑 细菌数量 非致龋性菌斑变链球菌 多 粘性放线血链球菌 血链球菌粘性放线 变链球菌乳酸杆菌 少 乳酸杆菌,致牙周病菌斑与非致牙周病菌斑的细菌构成,（二）化学组成,1. 水 占菌斑体积的30%-50%，重量的80%， 其中50%在菌细胞内，30%在菌斑基质 中。基质中的水大约25%呈游离状态， 剩余部分与蛋白质结合呈结合态。,2. 蛋白质和氨基酸 蛋白质占牙菌斑干重40%-50%，主要来自宿主唾液和龈沟液，少量来自细菌。细菌蛋白则包括细菌本身以及细菌产生的酶，以及免疫球蛋白和少量的氨基酸。,3. 糖 占牙菌斑千重的13%-18%，来源于食物和细菌，包括低分子可溶性糖，如单糖、双糖、低聚糖和多糖。,细胞内多糖（Intracellular Polysaccharides, IPS） 存在于细菌体内，作为一种储能形式，当外源性糖提供不足时，为菌斑细菌的新陈代谢提供能源。主要为糖原和支链淀粉。,细胞外多糖（extracellular polysaccharides, EPS） 存在于细菌体外，主要有葡聚糖、果聚糖和少量的杂聚糖。细胞外多糖分为水溶性和水不容性两种。,不同底物对生物膜EPS的影响,PLoS Pathog 8(4): e1002623.,生物膜形成过程中细菌细胞与EPS组成的动态变化,PLoS Pathog 8(4): e1002623.,4. 脂质 占菌斑干重10%-14%，多位于菌斑基质中，主要有磷脂、糖脂和中性脂。菌斑中的脂质对菌斑的矿化和细菌对牙面的粘附有一定影响。,5. 无机物 占菌斑干重的5%-10%，主要有钙、磷、镁、钠、钾及少量的铜、铁等。无机物一部分位于菌细胞内，另一部分分布于菌斑液中。菌斑具有集中钙、磷、氟的能力，菌斑中钙、磷、氟含量明显高于唾液。,五、形成和发育,The Biofilm Life Cycle,1、获得性膜的形成 2、细菌的黏附和集聚 3、生物膜的成熟 4、生物膜的分散,（一）获得性膜的形成,唾液糖蛋白选择性吸附在牙齿表面所形成。,1. 形成机制,获得性膜的形成机制,Enamel crystals,Pellicle lipid/protein layers (1-10 m),2. 组成 糖蛋白、酸性富脯蛋白、富酪蛋白、白蛋白、氨基酸、脂类物质、碳水化合物、一些酶和免疫球蛋白等。,3. 生物学作用 （1）确定首先定植在牙面的细菌种类 （2）细菌代谢的营养来源 （3）保护釉质表面 （4）牙面上的离子保护库,1. 细菌的黏附：细菌在牙面上的附着 （1）钙桥作用 （2）氢键作用 （3）疏水作用 （4）受体粘结素作用,（二）细菌的黏附和集聚,钙桥作用,氢键作用,疏水作用,疏水基团,疏水蛋白,黏附素与受体,黏附素（Adhesin）：细菌表面的蛋白样成分，以立体化学的特异方式结合到组织表面的受体上 受体（Receptor）：组织表面与黏附素结合的物质,黏附素与受体结合模式,主要口腔细菌的黏附素和受体,2. 集聚（aggregation） 一种细菌黏附于另一种细菌的表面称之为集聚,（1）细菌间通过自身合成的细胞外聚 合物而相互粘附（2）不同种细菌直接粘附在一起（3）细菌与宿主的聚合物相互作用， 使细菌容易聚集在菌斑中,（三）牙菌斑生物膜的成熟,牙菌斑的生长周期成熟牙菌斑的形态结构特征,牙菌斑的发育,牙菌斑（LM）,栅栏状结构（LM）,谷穗状结构（SEM）,谷穗状结构（FISH）组合标签和光谱成像,（四）生物膜的分散,生物膜的分散,Biofilms can propagate through detachment of small or large clumps of cells, or by a type of seeding dispersal that releases individual cells. Either type of detachment allows bacteria to attach to a surface or to a biofilm downstream of the original community,Nature Reviews Microbiology. 2012; 10(1): 39-50,生物膜的分散,分散形式：主动分散（active dispersal）：在外来刺激下，如营养变化、代谢产物堆积、温度变化、噬菌体攻击、酰基高丝氨酸内酯(AHL)、右旋氨基酸等作用下进行；主动分散的细菌具有独特的生物学特性，如鞭毛相关编码基因被激活，细菌运动能力显著增强；被动分散（passive dispersal）：如唾液冲刷、食物咀嚼等，菌细胞无生物学特性改变,环二鸟苷酸(c-di-GMP)是生物膜分散的核心分子,Nature Reviews Microbiology. 2012; 10(1): 39-50,Essential Steps of Biofilm Life Cycle,六、物质代谢,1. 分解代谢 产生多种有机酸，如乳酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸。,（一）糖代谢,2. 合成代谢 （1）细胞内多糖：糖原、支链淀粉 （2）细胞外多糖： Soluble ECP: -1,6 糖苷键 葡聚糖(右旋糖苷) -2,6糖苷键 果聚糖(左旋糖苷) Insoluble ECP: -1,3糖苷键 葡聚糖(glucan) 变聚糖 -2,1糖苷键 果聚糖(fructan),（二）碱性物质代谢 当牙菌斑处于饥饿状态时，菌斑内尿素酶能够将唾液中尿素分解为氨，二氧化碳，使牙菌斑pH上升。同时，菌斑中细菌可以利用氨基酸，使菌斑pH下降/上升。目前认为，细菌的产碱代谢是龋病发生的保护因素，口腔主要的产碱细菌包括格式链球菌、唾液链球菌、血链球菌、内氏放线菌等。,尿素酶(urease)及精氨酸脱亚胺酶(arginine deiminase)是口腔细菌最主要的两条产碱代谢通路，对维持口腔微生态平衡具有重要意义,（三）无机物代谢 在酸性环境中，磷酸盐会变为易溶解的相，钙释放到基质中。当菌斑pH下降到临界时(低于pH5.5)，羟磷灰石就会转化为钙/磷比值低的盐：Ca10(PO4)3(OH)2+8H+6CaHPO4+2H2o+4Ca2+,在酸性条件下，磷酸氢钙(CaHPO4)进一步分解：CaHPO4+H+Ca2+H2P4O 当牙菌斑pH上升，这时牙菌斑的钙/磷比值又将增高。10CaHPO4+8OH-Ca10(PO4)3(OH)2+4HPO42-+6H2O,七、致病性,牙菌斑是造成人类两大口腔疾病-龋病、牙周病的始动因子。,（一）牙菌斑与龋病 1. 龋病是发生于牙齿硬组织的慢性细菌 性疾病，表现为牙体硬组织色、形、 质的改变。 2. 致病性 （1）产酸性 （2）合成细胞外多糖对牙面的粘附能力（3）耐酸性,Stephan曲线,Stephan 曲线：进食后菌斑原位pH变化过程甜食频率 vs 甜食的量再矿化vs龋病形成所需时间,细胞内、外多糖的种类和作用1.种类:葡聚糖、果聚糖和少量的杂聚糖以及糖原和支链淀粉2.作用: 作为菌细胞壁成分或位于胞内。 作为菌斑基质的主要成分，构成菌斑的基本骨架。 作为细菌代谢所需的能源。 促进细菌对牙面的粘附和细菌间的聚集。,糖的种类与pH,（二）牙菌斑与牙周病 牙周病是发生在牙的支持组织的疾病，主要临床症状是牙龈出血、溢脓、牙齿松动、牙槽骨吸收以及牙周袋形成，该病是造成成年人失牙的主要原因之一。,1. 牙菌斑代谢产物的直接破坏作用 （1）酶 （2）毒素 （3）其他产物,2. 牙菌斑引起的免疫病理损害 免疫反应的类型是以细胞免疫为主，体液免疫参与，补体系统加入反应两个方面，在牙周炎症的不同阶段，各有特点。,小 结,牙菌斑,定 义,基本结构,组 成,形成和发育,代 谢,致病性,分 类,Hot Topics for