第五章 致病微生物检验

第五章 致病微生物检验 Examinations of Pathogenic Germs 沙门氏菌 大肠杆菌 O157:H7 霍乱弧菌 主要内容 食源性疾病 致病性微生物 沙门氏菌检验 金黄色葡萄球菌检验 一、食源性疾病 食源性疾病的定义： “ 两人或两人以上在进食同种食品后患相同的疾病，通常是胃肠道疾病，经分析确定食品是引发疾病的根源 ” 。 在所有食源性疾病爆发案例中，约 66由细菌性致病菌引起。常见的致病菌有：葡萄球菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌、肉毒杆菌、志贺氏菌、弯曲杆菌、李斯特菌、大肠杆菌、甲肝病毒等。 根据 WHO估计： 发达国家食源性疾病的漏报率在 90%以上 发展中国家食源性疾病的漏报率 95%以上 “冰山一角” 微生物性食源性疾病的特点 1 与饮食有关 ， 不吃者不发病 。 2 引起疾病的原因食品除掉后 ， 不再有新的患者发生 。 3 发病呈暴发性 ， 而且表现的临床症状一致 。 4 发病季节性强 。 5 中毒症状以急性胃肠炎为主 ， 不具有传染性 6 从病人和原因食品中均可检测到同样 （ 同一血清型 ） 的病原微生物或微生物毒素 二、致病微生物 致病微生物：能引起人体或动物体发生传染病的微生物，称为病原微生物或致病微生物。 主要包括肠炎沙门氏菌、致病性大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生性李斯特菌、霍乱弧菌、致病性链球菌等。 致病性 致病性： 病原性细菌引起传染的能力大小 ，主要依据的是微生物的毒力和侵染力大小。 细菌毒力： 细菌毒力的有无和毒力的强弱主要取决于它的侵袭力、产毒素性和引起超敏反应的能力。 1、细菌侵袭力 是指病原菌突破宿主的防御机能，并在其中进行生长繁殖和实现蔓延扩散的能力。 它由三方面组成：吸附和侵入能力，繁殖与扩散能力、对宿主防御机能的抵抗力。 主要取决菌体的表面结构及侵袭性酶。 2、细菌毒素 外毒素： 是病原菌在生长繁殖期间分泌到周围环境种的一种代谢产物，主要由革兰氏阳性菌产生，少数革兰氏阴性菌也能产生。其化学组成是蛋白质，抗原性强，毒性也强，但极不稳定，对热和某些化学物质敏感，容易受到破坏。 外毒素对机体的组织器官具有选择性，不同病原菌所产生的外毒素性质不同，所引起的症状也不同。 内毒素： 存在于细菌细胞壁的外层，属于细胞壁的组成部分，一般情况下并不分泌到环境中，只有当细菌溶解后才释放出来。大多数革兰氏阴性细菌能产生内毒素。其作用没有组织器官选择性，不同病原菌产生的内毒素引起的症状大致相同，都有机体发热、腹泻、出血性休克和其它组织损伤等表现，其毒性比外毒素要低，抗原性也弱。 3、超敏反应 又称变态反应，是机体再次受到相同抗原或半抗原刺激后，产生的体液性或细胞性的异常免疫反应，从而引起组织损伤或生理机能障碍。 细菌毒力 病原性细菌致病能力的强弱程度称为毒力。通常病原菌的毒力越大，其致病性就越强。 同一种病原菌，因菌株数不同，致病力大小也不相同，它的毒力也有强毒、弱毒和无毒株之分。 细菌毒力测定 细菌的毒力测定，在微生物实验研究中特别重要，尤其在疫苗效价，血清效价检定、细菌毒素的测定、食品毒理研究等，都必须预先将实验用的细菌（或毒素）的毒力加以测定。 测定微生物毒力大小系用递减剂量的材料（活的微生物或毒素）感染易感动物来进行。每次试验时，均须注意实验动物的种别、年龄与体重、试验材料和剂量、感染途径以及其它因素。 通用来表示微生物毒力大小的单位有最小致死量（ M.L.D）和半数致死量（ LD50 ）两种。 最小致死量（ M.L.D） 能使特定的动物感染后，在一定时限内发生死亡的最少活的微生物量或毒素量。 这一测定毒力的方法比较简便。有时可能由于实验动物个体差异而结果有误差。 半数致死量（ LD50 ） 在一定的时限内能使半数实验动物感染后发生死亡所需的活的微生物量或毒素量。 试验时要选择年龄、大小、体重一致的动物，将动物分为若干个组，每组动物数量相等。然后用等量的试验材料感染同一组动物。各组动物所用的试验材料量均有一定差数。对每组动物加以记录，然后用数学方法计算半数致死量。 最小感染量和半数感染量 最小感染量（ M.I.D）是病原微生物对试验对象（试验动物、鸡胚胎、细胞培养）能引起传染发生的最小剂量。 半数感染（ ID50 ）是病原微生物能对半数试验对象发生感染的数量。 剂量确定的误差 宿主对病原菌的易感性有高度差异； 病原菌侵袭力的变化范围大； 病原菌菌株间的毒力差别大； 病原菌的致病力易受因频繁突变产生的遗传变异的影响； 食品或人体消化系统的其它细菌的拮抗作用可能影响致病力； 食品本身会改变细菌的感染力和 /或影响宿主。 致病菌检验基本流程 前增菌： 用 含有营养的 无选择性的培养基使处于濒死状态的 M恢复活力 增菌（选择性增菌）： 含选择性抑制剂的促生长培养基 ,使目的菌优势繁殖，其它细菌受到抑制 分离纯化： 采用固体选择性培养基，抑制非目的菌的生长， 分离出所需的细菌， 提供肉眼可见的疑似纯菌落的识别。 观察群体形态和个体形态（包括革兰氏染色） 生化鉴定： 排除大多数非目的菌。也提供了目的菌培养物菌属的初步鉴定 （到属） 血清学分型鉴定： 进一步鉴定到种甚至型。 毒素测定 检验标准与方法 中国标准 GB/T4789 进出口食品检验商业行业标准 SN/T 美国食品药品管理标准 FDA 美国官方分析化学家协会 AOAC 加拿大食品检验标准 CFIA ISO标准 三、沙门氏菌 Salmonella 其中许多为人畜共患病 一大群人与动物肠道中的寄生菌 菌群菌型甚多，仅少数对人致病 沙门氏菌 流行病学特点 1 季节性特点全年皆可发生 ， 多见于夏 、 秋两季 。 5 10月发病起数和发病人数可达全年发病总起数和总人数的 80 。 2 食品种类沙门氏菌食物中毒的食品主要为动物性食品 ， 特别是畜肉类及其制品 ， 其次为禽肉 、 蛋类 、 乳类及其制品 ， 由植物性食品引起者很少 。 3 食品中沙门氏菌的来源由于沙门氏菌属广泛分布于自然界 ， 在人及动物 ， 如家畜中猪 、牛 、 马 、 羊 、 猫 、 犬 ， 家禽中鸡 、 鸭 、 鹅等均有广泛的宿主 ， 因此 ， 沙门氏菌污染肉类食物的几率很高 。 发病率及影响因素 沙门氏菌食物中毒发病率较高 ， 占总食物中毒的 40 一 60 ， 最高可达 90 。 沙门氏菌致病力强弱与菌型有关 ， 致病力越强的菌型越易致病 ， 猪霍乱沙门氏苗致病力最强 ，其次为鼠伤寒沙门氏菌 ， 鸭沙门氏菌致病力较弱； 沙门氏菌致病力强弱与易感人群有关 ， 对于幼儿 、 体弱老人及其他疾病患者等易感性较高的人群 ， 即便是较少菌量或较弱致病力的菌型仍可引起食物中毒 ， 甚至出现较重的临床症状 。 沙门氏菌 （ Salmonella） 生物学性状 形态与染色 :大小 0.7 1.5 2。 0 5。 0um，无芽胞，多具有鞭毛，能运动，有时会出现无鞭毛的突变型，无荚膜，多数有菌毛，革兰氏阴性杆菌。 培养特征： 兼性厌氧菌，最适生长温度 35-37 ，最适生长 PH为 6.8 7.8。在普通琼脂平板上形成圆型，光滑，湿润，半透明，中等大小、 S型菌落。在肠道菌选择性培养基上菌落小至中等，透明或半透明，乳糖不发酵，有些能产生硫化氢的菌株，在 ws琼脂上形成中心黑色的菌落。 沙门氏菌 （ Salmonella） 生物学性状 营养需求： 水分丰富的动物性食品， w要求0.945以上、 pH要求 4，生长温度范围 546 ，耐温性差（ 100 、立即死亡，巴氏消毒） 生化反应： 不发酵乳糖和蔗糖，不产生吲哚，不分解尿素， VP试验阴性，大多产生硫化氢。发酵葡萄糖、麦芽糖和甘露醇，除伤寒杆菌产酸不产气外，其他沙门氏菌均产酸产气。 菌 名 动力 葡萄糖 乳糖 麦芽糖 甘露醇 蔗糖 硫化氢 吲哚 甲基红 VP 枸 橼 酸 盐 甲型副伤寒沙门菌 + /+ + 乙型副伤寒沙门菌 + + + 鼠伤寒沙门菌 + + + + 丙型副伤寒沙门菌 + + + + 猪霍乱沙门菌 + +/ + + 伤寒沙门菌 + + + + /+ + 肠炎沙门菌 + + + 常见沙门菌的主要生化特性 沙门氏菌抗原结构 菌体抗原 O抗原 (细菌细胞壁上的脂多糖 -蛋白质，能耐热 100 达数小时不破坏。 )用于沙门氏菌的分群（ 5群， 58种）。 鞭毛抗原 H抗原 (蛋白，不稳定，加热或酒精处理都能被破坏。 )用于沙门氏菌的分型。 表面抗原 K抗原 主要包括 Vi抗原（毒力抗原，具有抗吞噬和抗溶菌作用，多数沙门氏菌没有该抗原） M抗原（黏液抗原，多数沙门氏菌在特定条件下会产生，如室温、含甘油或高浓度盐） 沙门氏菌属分类 7个亚属 ,大多数属于 亚属。 5个种：猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、亚利桑那沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌。 猪霍乱沙门氏菌可分为 7个亚种。 3000个血清型，在我国发现 255个。 已知能够引起人类致病的有 57个型，主要在 A-F群内。 抵抗力 （生存能力） 本属细菌抵抗力不强， 601 小时或 65 经 1520分钟可被杀死， 5%石炭酸溶液及 70%酒精 5分钟均可将其杀死。在水中能生存 2 3周，在粪便中可生存 1 2个月，在冰中能生存 3个月，可在冰冻土壤中过冬，在牛乳和肉类食品中，存活数月，在食盐含量为 10 15的腌肉中亦可存活 2 3个月。 。 胆盐、煌绿等对本属细菌的抑制作用较对其他肠道杆菌为小，故可用其制备肠道杆菌选择性培养基，利于分离粪便中的沙门氏菌。对氯霉素、氨苄青霉素和复方新诺明敏感。 沙门氏菌 （ Salmonella） 致病力 侵袭力 （ O、 Vi抗原） ：沙门氏杆菌侵入小肠粘膜上皮细胞，穿过上皮细胞层到达上皮下组织。 因为 VI抗原使其 被细胞吞噬，但不被杀灭，并在其中继续生长繁殖。 内毒素：引起发热、白细胞减少。大剂量时可发生中毒性休克。内毒素可激活补体系统释放趋化因子，吸引粒细胞，导致肠道局部炎症反应。 外毒素（肠毒素）：有些沙门氏杆菌，如鼠伤寒杆菌可产生肠毒素，性质类似肠产毒性大肠杆菌的肠毒素。 侵染力（致病因子） 沙门氏菌具有侵袭性，引起粘膜炎性反应，伴粘膜下层中性粒细胞浸润，有时可深至固有层。 1、 沙门氏菌经口进入人体以后 ， 在肠道内大量繁殖 ， 经淋巴系统进入血液 ， 造成一次性菌血症 ， 即感染过程 。 2、 沙门氏菌在肠道和血液中受到机体的抵抗而被裂解 、 破坏 ， 释放大量内毒素 ， 使人体中毒 ， 出现中毒症状 。 临床表现 （ 1）肠炎型 (食物中毒 )： 是沙门氏菌感染最常见的形式，潜伏期一般为 8 24小时。起病急骤，常伴有恶寒、发热，但热度一般不甚高，同时出现腹绞痛、气胀、恶心、呕吐等症状。继而发生腹泻，一天数次至十数次或更多，如水样，深黄色或带绿色，有些有恶臭。 细菌通常不侵入血流，病程较短，一般 2 4天内可完全恢复。 (2)伤寒型： 是伤寒病和副伤寒病的总称，主要由伤寒杆菌和甲、乙、丙型副伤寒杆菌引起。病菌进入淋巴系统后，再侵入血液。病人持续高热，相对缓脉，肝脾肿大及全身中毒症状，部分病例皮肤出现玫瑰疹。 非伤寒沙门氏细菌感染时，可引起类似伤寒的临床表现，其中以猪霍乱菌较常见。症状一般较伤寒轻，长期发热，伴胃肠道症状，或以胃肠炎为前驱表现，皮疹少见，腹泻较多，可见脾肿大，白细胞总数低下，而肠穿孔、肠出血等并发症少。病程大多仅 1 3周，血和粪便培养可获有关沙门氏菌。 （ 3）败血症型： 常由猪霍乱杆菌、丙型副伤寒杆菌、鼠伤寒杆菌、肠炎杆菌等引起。病菌进入肠道后，迅速侵入血流，导致组织器官感染，如脑膜炎、骨髓炎、胆囊炎、肾盂肾炎、心内膜炎等。出现高热、寒战、厌食、贫血等。 在免疫功能正常的宿主中，沙门氏菌感染引起败血症的机会不到 10%。本型以长期发热为主要特征，体温可高达 40 以上，呈不规则热 (弛张热或间歇热 )，伴反复寒战、出汗、头痛、恶心、厌食、体重下降，部分患者有胃肠炎症状，偶见脾肿大，约 1/4患者在病程中出现局部感染病灶，以骨关节最常见，且可累及多关节，迁延不愈，形成瘘管。 胆囊 -肠道 -粪排菌 皮肤 -血拴出血 -玫瑰疹 肾 -尿 肝脾 -肿大 骨髓 -受抑制 伤寒和付伤寒杆菌 小肠上部粘膜 肠系膜淋巴结 固有层淋巴结 进入血液 再次进入血液 第一次菌血症 第二次菌血症 伤寒和付伤寒的致病过程 沙门氏菌检验流程 GB4789.4-2010 TTB增菌液 适合大多数沙门氏菌生长，但不利于伤寒沙门氏菌生长。有部分变形杆菌生长。 加入胆盐和煌绿，抑制 G+和E.coli 硫代硫酸钠与碘反应，产生的四硫酸钠，抑制 E.coli 碳酸钙可以稳定硫代硫酸钠，并中和杂菌产生的酸，放出CO2， 同时抑制有氧呼吸菌。 SC增菌液 适合伤寒和副伤寒沙门氏菌生长；其他部分肠道杆菌和假单胞菌也会生长。 亚硒酸钠和 L-胱氨酸制造了低氧化还原电位，并抑制 G+菌和部分 G-（大肠菌群和肠球菌） 磷酸缓冲液使系统 pH维持在 7.0-7.4。确保亚硒酸盐的作用最强。 沙门氏菌 在各种选择性琼脂平板上的菌落特征 沙门氏菌检验选择性分离培养 XLD琼脂： FDA BAM典型菌落：粉色菌落，带或不带黑色中心。许多沙门氏菌培养物可呈 现大的具光泽的黑色中心或几乎为全部黑色的菌落。 非典型菌落：黄色带或不带黑色中心。 ISO中心黑色、周围由于指示剂颜色的改变而出现红色的轻微透明带。 菌名 菌落形态 鼠伤寒沙门氏菌 红色 ， 有黑心 伤寒沙门氏菌 红色 ， 有黑心 弗氏志贺氏菌 红色 大肠埃希氏菌 黄色 ， 有胆盐沉淀环 粪链球菌 - 沙门氏菌检验选择性分离培养 BS琼脂： FDA BAM典型菌落：产硫化氢菌落黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周 围的培养基通常开始呈褐色，但伴随培养时间的延长而 变为黑色，并有晕环效应； 非典型菌落：有些菌株不产生硫化氢，形成灰绿色菌落，周围培养 基不变色。 菌名 菌落形态 伤寒沙门氏菌 黑色 ， 有金属光泽 鼠伤寒沙门氏菌 黑色 ， 有金属光泽 奇异变形杆菌 褐色或呈黑色 ， 无金属光泽 弗氏志贺氏菌 棕色至绿色 大肠埃希氏菌 棕色至绿色 粪链球菌 - 50071 44104 Blank 50115 沙门氏菌在选择性分离平板上的特征 BS BS中的亚硫酸铋、煌绿和柠檬酸铋铵可抑制变形杆菌、大肠杆菌和假单胞菌 沙门氏菌检验选择性分离培养 HE琼脂： FDA BAM典型菌落： 兰绿色至兰色，多数菌株产硫化氢，菌落带或不带黑色 中心或几乎全黑色。 非典型菌落： 乳糖阳性的菌株为黄色中心黑色或全黑色。 菌名 菌落形态 伤寒沙门氏菌 蓝绿色 ， 部分有黑心 鼠伤寒沙门氏菌 蓝绿色 ， 部分有黑心 奇异变形杆菌 蓝绿色 ， 有或无黑心 弗氏志贺氏菌 蓝绿色 大肠埃希氏菌 橙红色 ， 有胆酸盐沉淀 粪链球菌 - 溴麝香草酚蓝使沙门氏菌呈蓝绿色 沙门氏菌 （ Salmonella） 在 CHRO 琼脂上的菌落形态 酸性复红遇到细菌产酸会变成红色 生化试验注意事项 待检菌应是纯种培养物； 待检菌应是新鲜培养物：最好采用 18-24 h的新鲜培养物 ， 此时细菌群体细胞的生理特征比较一致 。 严格遵守观察反应的时间： 应做必要的对照试验：做阳性和阴性菌株对照试验 注意提高阳性检出率：至少应挑取 2-3个待检的疑似菌落 ， 分别进行试验 ， 菌落挑取数愈多 ， 阳性检出率相对愈高 。 沙门氏菌的 TSI试验 三糖铁（ TSI）琼脂试验 本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。 a. uninoculated b. little change/alkaline/-/- c. alkaline/acid/-/+ d. acid/acid/+/+ e. acid/acid/+/- slant color/ butt color/ gas production/ hydrogen sulfide production 沙门氏菌检验生化鉴定 TSI： 典型反应：斜面产碱（ K）： 红色 ； 底部产酸（ A）： 黄色 ； 产 H2S： 黑色 （少数不产） 菌名 生化反应 肠炎沙门氏菌 K/A， 产气 ， 产 H2S 大肠埃希氏菌 A/A， 产气 铜绿假单胞菌 K/K 奇异变形杆菌 K/A， 产 H2S 弗氏柠檬酸杆菌 A/A， 产 H2S 弗氏志贺氏菌 K/A 氨基酸脱羧酶试验 基础培养基： 蛋白胨 5g，酵母浸膏 3g，葡萄糖 1g，0.2溴麝香草酚蓝溶液 12ml，蒸馏 1000ml 调 pH至 6.8，在每 100ml的基础培养基内，加入所需要测定的氨基酸 0.5g，所加的氨基酸应先溶解于NaOH溶液内。加入氨基酸后，调整 pH至 6.8，分装于灭菌小试管内，每管 10ml， 0.112MPa高压灭菌 10分钟。 试验时，接种被检物于上述培养基中，上面滴加一层无菌液体石蜡， 37 培养 1 4天，培养液由黄色变为蓝紫色者为阳性，阴性者为黄色色。 沙门氏菌在 TSI和赖氨酸脱羧酶试验中的反应结果 挑取 2个以上可疑菌落，接种 TSI，先画斜面，后穿刺；同时，接种赖氨酸脱羧酶实验管和营养琼脂。 已挑选的可疑菌落平板，要保留在 2-4 ， 24h以上。 尿素酶试验 有些细菌能产生尿酸酶，而分解尿素，试验时，将被检菌接种于培养基中，室温放置，经 5小时和 24小时观察结果，如培养基变红，表示尿素被分解（阳性）。因为培养基中含有 0.2酚红溶液，在碱性条件下呈红色。 制作培养基时，由于尿素受热会分解，所以，应采取过滤除菌的方法。 氰化钾试验 于基础液中加入 15ml 0.5氰化钾溶液，分装于灭菌小试管中，每管 1ml，立即用蘸有热石蜡的软木塞塞紧，可于冰箱中保存 2周。试验时，将被检物接种到氰化钾培养基中，立即用软木塞塞紧， 37 培养，连续观察 2天，有细菌生长时为阳性反应。 注意： 氰化钾为剧毒，易挥发；宜在低温环境和通风厨内操作。 靛基质（ Imdole） 试验 某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。 试验方法：将待试纯培养物小量接种于试验培养基管，于 36 1C培养 24h时后，取约 2ml培养液，加入Kovacs氏试剂 23滴，轻摇试管，呈红色为阳性，或先加少量乙醚或二甲苯，摇动试管以提取和浓缩靛基质，待其浮于培养液表面后，再沿试管壁徐缓加入Kovacs氏试剂数滴，在接触面呈红色，即为阳性。 生化反应初步鉴定表 反应序号 硫化氢 靛基质 氰化钾 pH7.2尿素 赖氨酸脱羧酶 A1 + - - - + A2 + + - - - A3 - - - - +/- 注： +阳性； -阴性； +/-阳性或阴性 反应序号 A1：典型反应判定为沙门氏菌属。 沙门氏菌属生化反应表 pH7.2尿素 氰化钾（ KCN） 赖氨酸 判定结果 甲型副伤寒沙门氏菌 （ 要求血清学鉴定结果 ） 沙门氏菌 或 （ 要求符合本群生化特性 ） 沙门氏菌个别变体 （ 要求血清学鉴定结果 ） 如尿素、 KCN和赖氨酸 3项中有 1项异常，按上表可判定为沙门氏菌。如有 2项异常，则判定为非沙门氏菌。 反应序号 A2：补做甘露醇和山梨醇试验 甘露醇 山梨醇 判 定 结 果 + + 沙门氏菌靛基质阳性变体 （ 要求血清学鉴定结果 ） 缓慢胺德华氏菌 现象：培养基变成黄色（产酸） 反应序号 A3：补做 ONPG ONPG+为大肠埃希氏菌， ONPG-为沙门氏菌。同时，沙门氏菌应为赖氨酸 +，但甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸 -。 ONPG: 邻硝基酚 D半乳糖苷 结果：呈现黄色为阳性反应，通常 20-30min内显色 注意：为提高阳性反应速度， 需大量接种培养物。过酸出现假阴性，过碱则出现假阳性。 各生化群鉴定（必要时进行） 商业生化鉴定 在进行了初步生化鉴定的基础上，将营养琼脂上的菌落用无菌生理盐水稀释，然后，接种至 API20E或 VITEK AMS，进行生化鉴定。 Vitek AMS原理 根据慨率最大似然模型法通过计算机控制阅读器每小时对温室中的测试卡自动测试一次 ， 进行光学扫描检验并转为电信号 ， 每个测试卡包括 30项生化试验 。 当反应结束后 ， 计算机将最终的结果与数据库中标准菌进行比较 ， 从而；鉴定出结果 。 全自动微生物鉴定系统 配制溶液 扫描卡片条码 卡片载入卡片底盘 真空填充接种卡片 卡片载入仪器 取出用过的卡片 鞭毛抗原（ H） 菌体抗原（ O） K或 Vi抗原 血清学分型鉴定 抗原的准备 一般采用 1.5%琼脂斜面培养物作为玻片凝集试验用的抗原。 O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的 (如2.5%一 3%)培养基上再检查； 如果是由于 Vi抗原的存在而阻止了 O凝集反应时，可挑取菌苔于 1mL生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。 H抗原发育不良时，将菌株接种在 0.7% 0.8%半固体琼脂平板的中央，候菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查。 抗原抗体反应的特点 特异性 按比例 可逆性 血清学分型鉴定 O抗原的鉴定 用 A F多价 O血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株，不能分型。 被 A F多价 O血清凝集者，依次用其他因子血清做凝集试验。根据试验结果，判定 O群。 不被 A F多价 O血清凝集者，先用 57种或 163种沙门氏菌因子血清中的 9种多价 O血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括的 O群血清逐一检查，以确定 O群。 血清学分型鉴定 H抗原的鉴定 属于 A F各 O群的常见菌型，依次用 H因子血清检查 H抗原。 Vi抗原的鉴定 用 Vi因子血清检查。已知具有 Vi抗原的菌型有：伤寒沙门氏菌，丙型副伤寒沙门氏菌，都柏林沙门氏菌。 菌型的判定和结果报告 综合以上生化试验和血清学分型鉴定的结果 ， 按照有关沙门氏菌属抗原表判定菌型 ， 并报告 25克检样中检出或未检出沙门氏菌属 。 GB 4789.31 -2013 沙门氏菌噬菌体诊断检验 沙门氏菌检测 1-2 Test 是 Biocontrol公司的专利产品，被全世界的客户广泛采纳，专门用来检测沙门氏菌。它利用免疫扩散原理，将科学和实际应用，结果的可靠性和容易使用结合在一块。每个试剂都是独立包装，包含实验所需要的所有试剂。实验结果肉眼可见，不需要配备仪器。 2B 加 1mL未增菌混合物于 9mL碘激活的 TBG培 养 液 中 ， 在42 0.5 水浴 培养 6-8h。 1B 参考新版细菌学 分 析 手 册（ BAM ） 准备样品 。 35-37培养 24 2h。 其它方法 SN:与国标法基本一直 美国 FDA：对不同的食物采取不同的前增菌方式（温度、时间、 pH等）和培养基。 AOAC：将食品分为即食、未加工和加工食品三类，而且全部进行长时间前增菌。 ISO：全部进行长时间前增菌，而且增加接种检样量。 四、金黄色葡萄球菌检验 (staphylococcus aureus) GB 4789.10-2010 简介 葡萄球菌（ Staphylococcus)是微球菌科的一个属。 葡萄球菌分为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌。其中金黄色葡萄球菌(staphy aureus)为致病菌、表皮葡萄球菌偶尔致病（ staphy epidermidis)、 腐生葡萄球菌（ staphy saprophyticus)一般为非致病菌。 浙江 CDC 2000-2004年监控结果： 金黄色葡萄球菌在生牛奶、熟肉制品及冰激凌等 3类食品中的检出率为 19.67%；前两种食品的污染率分别为25.13%和 20.33%。 金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。作为人和动物的常见病原菌，其主要存在于人和动物的鼻腔、咽喉、头发上， 50%以上健康人的皮肤上都有金黄色葡萄球菌存在。因而，食品受其污染的机会很多。 生境 污染食品途径 1、食品加工人员、炊事员或销售人员带菌，造成食品污染（ 正常人带菌，30-80% ）； 2、食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生了肠毒素，引起食物中毒； 3、熟食制品包装不严，运输过程受到污染； 4、奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时，对肉体其他部位的污染。 金葡感染 染色观察 在 BP平板上的典型菌落 大阪市政府日宣布的调查结果显示，因食用日本雪印乳业公司大阪工厂生产的乳制品而中毒者已逾万人。 在大阪府和京都府以及附近县，因食用雪印乳业公司大阪工厂生产的乳制品而中毒发病者已达人，其中有人被送往医院，目前还有人在医院接受治疗。 据化验，该工厂生产的一些乳制品中含有黄色葡萄球菌，这种细菌可产生使人出现腹泻、呕吐症状的型肠毒素。该厂乳制品染菌是生产设备没有按规定定期清洗而造成的。 目前，日本各地超市和食品店都已停止销售雪印牌乳制品，一些地方政府已下令禁止食用雪印牌食品。大阪雪印厂已被当地政府勒令无期限停产，并且大规模回收月下旬出厂的几种染菌食品。 总部设在北海道首府札幌市的雪印乳业公司是日本著名乳制食品厂家。该公司在全国共拥有家工厂，其中家工厂加工生产牛奶、牛奶饮料、酸奶等奶品。 媒体关于日本雪印牛奶金黄色葡萄球菌中毒事件的报道 日本因食用染菌乳制品中毒者已逾万人 (2000年 7月 6日 12:39) 小结 个体与群体特征： 兼性 、 球形 、 无鞭毛 、 无芽孢 、 G ， 污染食品后不易引起感观变化； 营养需求： 水分 、 蛋白质 、 淀粉丰富的基质 ，但 w为 0.85、 18 的盐水中仍可生长 ， 生长温度范围 6.546 ， 冰冻下可存活； 宿主与病症： 主要宿主是人和动物 ， 可引起胃肠炎； 预防措施： 良好的个人卫生 ， 最终灭菌温度应高于 80 、 30min， 减少加热后半成品积压时间 。 培养特性 在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度 37 C，最适生长 pH 7.4。 平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。 金黄色葡萄球菌有 高度的耐盐性 ，可在 10-15%NaCl肉汤中生长。 生化特性 多数葡萄球菌菌株分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、产酸不产气，致病性葡萄球菌在厌氧条件下分解甘露醇、产酸，非致病性葡萄球菌无此作用。 甲基红反应阳性， VP反应弱阳性。 许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。 金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。 致病力 金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶： a.溶血毒素：外毒素，分 、 、 、 四种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死； b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞； c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。 d.脱氧核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温。 e.肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，分为 A、 B、 C、 D、 E及 F五种血清型。 流行病学 季节分布，多见于春夏季； 中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。 上呼吸道感染患者鼻腔带菌率 83%，所以人畜化脓性感染部位常成为污染源。 肠毒素形成条件： 存放温度，在 37 C内，温度越高，产毒时间越短； 存放地点，通风不良氧分压低易形成肠毒素； 含蛋白质丰富，水分多，同时含一定量淀粉的食物，肠毒素易生成。 临床症状 潜伏期一般为 1 6小时 ， 最短者 0.5小时即发病 。 症状主要是恶心 、 呕吐 、 流涎 ， 胃部不适或疼痛 ， 继之腹泻 (但少见 )。 呕吐为多发症 ， 为喷射状呕吐 ， 一般腹泻后多有腹痛 ， 初为上腹部后成全腹部 ， 呕吐或便中常可见有血和粘液 。 少数患者有头痛 、 肌肉痛 、 心跳减弱 、 盗汗和虚脱现象 。 体温不高 ， 不超过 38C， 病程 1天 ，呈急性经过 ， 很少有死亡 ， 预后良好 。 微生物学 定性检验 增菌培养法 方法： 吸取 5mL上述混悬液，接种于7.5%氯化钠肉汤或胰酪陈大豆肉汤 50mL培养基内，置 36 1 温箱培养 24h。 现象：在肉汤中呈混浊生长，在胰酪陈大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈混浊生长 。 7.5%氯化钠肉汤 成分 ：蛋白胨 10g 牛肉膏 3g 氯化钠 75g 蒸馏水 1 000mL pH7.4 制法 ：将上述成分加热溶解 ,校正 pH,分装试管 ,121 高压灭菌 15min。 胰酪胨大豆肉汤 成分：胰酪胨 (或胰蛋白胨 ) 17g 植物蛋白胨 (或大豆蛋白胨 ) 3g 氯化钠 100g 磷酸氢二钾 2.5g 葡萄糖 2.5g 蒸馏水 1 000mL 制法 ： 将上述成分混合 ,加热并轻轻搅拌并溶解 , 分装后 ,121 高 压 灭 菌 15min, 最终pH7.3 0.2。 分离培养 从增菌液中转种血平板和 Baird Parker平板，36 1 培养 24h。 血平板上菌落呈金黄色，也有时为白色，大而突起、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。 在 Baird Parker平板上为圆形、光滑凸起、湿润、直径为 2 3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。 细菌的溶血现象 根据细菌对红细胞的溶解能力可分为以下三种溶血类型及现象： （甲型）溶血 :产生溶血素，不完全性溶血，在血琼脂平皿上菌落周围有 1 2mm，较窄半透明的，草绿色溶血环。 （乙型）溶血 :呈完全性溶血，在血平皿上菌落周围有2 4mm宽、界限分明、无色透明的溶血环。 （丙型）溶血 :不产生溶血素，在血琼脂平皿上的菌落周围无溶血环。 溶血 血琼脂 成分 ： pH7.4 7.6豆粉琼脂 100mL 脱纤维羊血 (或兔血 ) 5 10mL 制法 ：加热溶化琼脂 ,冷至 50 ,以灭菌手续加入脱纤维羊血 ,摇匀 ,倾注平板 。 亦可分装灭菌试管 ,置成斜面 。 亦可用其他营养丰富的基础培养基配制血琼脂 。 原理： 适应金黄色葡萄球菌的生长 ， 菌落较大 ，颜色鲜明 ， 而且有鉴别溶血反应的作用 ， 可作为血凝固酶试验的补充 ， 增加致病菌株的检出机会 。 Baird-Parker氏培养基成分 胰蛋白胨 10g 牛肉膏 5g 酵母膏 1g 丙酮酸钠 10g 甘氨酸 12g 氯化锂 (LiCl6H2O) 5g 琼脂 20g 蒸馏水 950mL PH 7.5 Baird-Parker氏培养基制法 增菌剂的配法 ： 30%卵黄盐水 50mL与除菌过滤的 1%亚碲酸钾溶液 10mL混合 ,保存于冰箱内 。 制法 ：将各成分加到蒸馏水中 ,加热煮沸至完全溶解 。 冷至 25 , 校正 pH 。 分 装 每 瓶95mL,121 高压灭菌 15min。 临用时加热溶化琼脂 ,冷至 50 ,每 95mL加入预热至 50 的卵黄亚碲酸钾增菌剂 5mL,摇匀后倾注平板 。 培养基应是致密不透明的 。 使用前在冰箱储存不得超过 48h。 Baird-Parker氏培养基选择性鉴别原理 该平板中的氯化锂可抑制革兰氏阴性细菌生长 丙酮酸钠可刺激金黄色葡萄球菌生长，以提高检出率 利用分解甘露醇和血浆凝固酶等特征，以兹鉴别。 在 Baird-Parker琼脂平板上 的菌落形态 呈圆形 ,表面光滑、凸起、湿 润 ,直径 2 3mm。 灰黑色至黑色 ,有光泽 ,常有浅色 (非白色 )的边缘 ,周围绕以不透明圈 (沉淀 ),其外常有一清晰带。 当用接种针触及菌落时具有黄油样粘稠感。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落 ,其黑色常较典型菌落浅些 ,且外观可能较粗糙 ,质地较干燥。 在 Baird-Parker琼脂平板上 的菌落形态 2 不分解脂肪的菌株 ,除没有不透明圈和清晰带外 ,其他外观基本相同。 金葡萄球菌的菌落特征 培养基 菌落特征 Baird-Parker琼脂 圆形隆起 ， 光滑 ， 直径为 2 3mm， 呈灰色到