Agilent-HPLC使用过程中常见问题及解决方法

Agilent HPLC 使用过程中常见问题及解决方法使用过程中常见问题及解决方法 一 如何处理一 如何处理 HPLC 中的盐带来的问题 中的盐带来的问题 很多问题是由于流动相含有盐成分造成的 建议在清洗时将水加热后再冲洗 这样既可以 将盐溶解的更好 也可以溶解一些脂溶性物质 会减少很多问题的发生 包括管路堵塞 盐 析出 基线噪音 二 安捷伦二 安捷伦 1100 及及 1200 液相泵的日常液相泵的日常维护 泵是液相色谱的核心 泵将流动相从溶剂瓶输送到液相流路系统中 并要在高压下保持流 量和压力的稳定 泵的状态正常是液相色谱准确分析的基础 所以平日一定要重视对泵的 维护 下面就安捷伦 1100 1200 液相色谱泵的日常维护进行简要的介绍 1 流动相的准备流动相的准备 为了防止颗粒性物质对泵组件的磨损 流动相 特别是水相 应该新鲜配置并且过 滤 上机前对流动相进行适当的超声脱气 以保证更好的在线脱气和在线混合的效 果 2 比例阀溶剂通道的分配比例阀溶剂通道的分配 四元泵的比例阀有 A B C D 四个通道 建议将盐溶液接在下面的通道 A 或 D 将有机溶剂接在上面的通道 B 或 C 上 也就是有机通道最好在盐溶液通 道的上面 且建议用水定期冲洗所有比例阀通道除去可能在阀口析出的盐结晶 3 过滤白头的维护过滤白头的维护 过滤白头位于排气阀内 是一种聚四氟乙烯材质的微孔过滤芯 用于过滤流动相中 的微粒 是经常需要维护的地方 当系统压力有异常增高时 首先需要检查过滤白 头是否阻塞了 判断的方法是 打开排气阀 以纯水作流动相 将流速设为 5mL min 如果泵压超过 10bar 则说明过滤白头需要更换了 对过滤白头的预 防性维护通常可以是 1 2 个月更换 1 次 更换时同时检查一下过滤白头前面的密 封金垫 如果发现变形 也应及时更换 如果过滤白头更换过于频繁 则需要认 真检查一下流动相的品质 确保流动相上机前过滤 确保使用了合适的过滤膜 如 果流动相有长菌现象 除了配置新的溶剂 还应对相应的溶剂管线和脱气机通道进 行彻底的清洗 4 柱塞杆与柱塞密封圈的维护柱塞杆与柱塞密封圈的维护 柱塞密封圈套在柱塞杆上用于隔离泵与外界 工作时 它和柱塞杆进行频繁的往复 摩擦 使用一段时间后 会有一定的磨损 因而密封圈需要定期更换以保证系统的 密封性 更换活塞密封垫时检查活塞杆上是否有划痕 有划痕的活塞将导致轻度渗 漏 并降低密封垫的使用寿命 应尽早更换有划痕的活塞 柱塞密封圈有反相和正相之分 反相密封圈为黑色 石墨 Teflon 材质 正相 呈橘黄色 聚乙烯材质 更适用于正相溶剂 1100 1200 标配的是反相密封圈 正相应 用时 需要更换为正相密封圈 盐溶液对柱塞密封圈的寿命有着很大的影响 使用有盐溶液作为流动相的体系 时 要注意盐溶液通道的清洗 千万不能让盐溶液在系统中过夜 常常一个晚上析出的盐 粒就会造成系统堵塞 对泵产生较大的损害 为了延长密封圈和柱塞杆的寿命 在经常使 用较高浓度的缓冲盐溶液的情况下 建议安装柱塞清洗附件 柱塞清洗的原理在于 柱塞 泵在工作时 虽然有密封圈密封 但由于毛细作用 还是会有一些流动相渗入到密封圈与 柱塞杆之间 如果流动相中有缓冲盐 当柱塞杆壁上的溶剂挥发掉后 极细小的盐粒留了 下来 这样的盐粒就象砂纸一样磨损着柱塞杆和柱塞密封圈 会大大降低柱塞杆和密封圈 的寿命 柱塞清洗附件是在柱塞杆的中间加入了一个可以有水流过的腔体 通过水不断的 流动 就可以带走渗进来的盐溶液 防止了盐粒的析出 保护了柱塞杆和柱塞密封圈 通 常我们往柱塞清洗的水里加入 10 的异丙醇 可以减小水的张力 便于清洗液流动 并且 抑制长菌 但有一点要注意的是 装有柱塞清洗附件的泵头 清洗液流量可以很小 如没 分钟几滴 但一定不要让清洗通道里干涸 如果水流光了 应该尽快换上新的溶液 否 则会减少柱塞杆和密封圈的寿命 5 主动阀的维护主动阀的维护 主动阀是流动相进入泵体的门户 如果我们发现流量为零 流量不稳 或泵压波 动特别大 常常都是因为主动阀漏或是堵了 主动阀里面装有一个小的单向阀芯 我们将 其取下 在异丙醇内超声清洗一下 一般能解决这样的问题 如果超声不能解决问题的话 可以更换该阀芯 对于经常使用缓冲盐体系的用户 手头常备一个这样的阀芯是非常有用 的 往往可以及时解决问题 大大的降低停机带来的损失 6 出口阀的维护阀的维护 出口阀内部也有 如果有盐粒或其它杂质渗入其中 也会造成出口阀的堵或漏 常常表现为压力的异常波动 通常我们可以用异丙醇或 60 度左右的热水冲洗系统 如果 无效 在异丙醇中超声清洗它常常会解决这样的问题 三 保留时间重现性不好 可能的原因有哪些 三 保留时间重现性不好 可能的原因有哪些 保留时间不重现还会影响到峰面积的重现性 导致实验无法进行 引起这种现象因素很多 建议检查以下几个方面 确认流动相是新鲜配置的 比例没有错误 确认色谱柱是好的 检查一下溶剂瓶里的溶剂过滤器没有长菌 没有被堵塞 如果使用梯度洗脱方法 请确认平衡时间足够长 仔细观察柱前压的变化 如果压力稳定 就可以判断泵的系统没有问题 请更换新的色 谱柱试试 如果是压力不稳定 一定会影响保留时间 四 柱前压不稳定 压力上下波动的常见原因 四 柱前压不稳定 压力上下波动的常见原因 引起这种故障最常见的原因是泵里有气泡 建议用以下的方法排除 如果系统没有配置脱气机 二元泵 溶剂一定要经常超声脱气 脱气机的效率不够 特别是用甲醇 水的系统最容易发生 可以将 A B 通道串联 C D 通道串联用来延长脱气的时间 效果非常明显 主动阀阀芯污染 可以将阀芯取下 用甲醇超声清洗 五 为什么排气阀里的过滤芯经常堵塞 五 为什么排气阀里的过滤芯经常堵塞 如果是排气阀里的过滤芯堵塞引起的压力升高 请仔细检查一下换下来的过滤芯 正常情 况下 一个过滤芯可以使用 6 个月左右 如果经常更换就有问题 如果过滤芯的颜色发黑 说明是被柱塞密封垫磨损下来的碎屑堵塞的 请确认流动相使 用的缓冲盐的浓度是否太高了 是否使用了柱塞清洗装置 缓冲液在泵头内部析出的盐的 结晶会加速密封垫的磨损 如果过滤芯的颜色是乳白色的 非常干净 说明过滤芯很有可能是被流动相污染了 请 检查一下是否使用了过期的溶剂 水 有机溶剂 或质量不好的溶剂 请马上更换别的 品牌的溶剂或使用纯净水 推荐 娃哈哈纯净水 如果流动相经过了滤膜过滤 请确认是否使用了正确的 优质的滤膜 建议先不要使用滤 膜过滤流动相 看看是否可以解决过滤芯堵塞的问题 如果存放缓冲液或水的溶剂瓶不经常清洗 该通路会生长藻类 藻类会污染整个流路系 统和脱气机的腔体 藻类及其代谢产物也会堵塞过滤芯 如果发生了这种情况 建议用 60 度的热水清洗溶剂瓶 并用异丙醇清洗整个管路和脱气机 建议一定要用棕色瓶存放缓冲溶液 避光 并且定期清洗溶剂瓶 六 峰面积或峰高重现性不好 偏差大 可能的原因有哪些 六 峰面积或峰高重现性不好 偏差大 可能的原因有哪些 如果 HPLC 系统配有自动进样器 这种情况主要是自动进样器的问题 首先确认柱前压是稳定的 保留时间的重现性好 将自动进样器的抽样速度降低到 50ul min 以下 默认值是 200ul min 如果样品粘 度较大 降低抽样速度可以极大地改善粘度较大的样品的进样精度 如果进样针或针座有轻微的堵塞 对进样精度的影响也非常大 如果是手动进样器 请确认一定要使用 Agilent 配的标准进样针 且进样器的废液出口 要与进样口水平 避免虹吸的影响 如果是满 Loop 进样 建议注射 5 倍 Loop 的进样体 积 七 自动进样器的针头或针座经常堵塞 如何处理 七 自动进样器的针头或针座经常堵塞 如何处理 如果针头或针座经常堵塞 请检查使用的进样瓶隔垫 质量不好和已经破损的隔垫易产 生很多碎屑 进样时 这些细小的碎屑很容易将针头 针座堵塞 使用 Agilent 的正规隔 垫并且经常更换旧的隔垫就可以避免这类问题 如果样品是经过离心处理的 是用针头吸取上清液进样 请将针头进样位置提高 如果针头或针座发生了堵塞 可以用以下简单的办法处理 通过 Chemstation 诊断界 面的更换针头 针座的程序将其取下 反接到泵的出口 用反吹的办法将其疏通 大部分 是可以顺利解决的 八 紫外检测器 八 紫外检测器 DAD VWD 信号波动大 噪音大 光强度检测通不过 如何处理 信号波动大 噪音大 光强度检测通不过 如何处理 引起这种问题的因素很多 要一步一步排除 直到找到问题真正原因 确定柱前压稳定 溶剂 高纯度的有机溶剂 水 使用正确 流动相脱气良好 检查检测器的氘灯是否已经到了使用寿命 是否更换过新的氘灯 用异丙醇清洗整个系统 更换过滤芯 排除污染源 清洗流动池和有关的透镜 需要工程师去现场服务 九 九 HPLC 出出 鬼峰鬼峰 如何排除 如何排除 HPLC 出 鬼峰 大部分发生在反相体系 甲醇 乙腈 水 是溶剂被污染造成的 还 有一种原因是进样系统有残留 先运行一个空白梯度洗脱的方法 从 100 水过渡到 100 有机溶剂 如果 鬼峰 出现 可以判断是水被污染了 水中有藻类 Algae 的污染 如果是使用纯水机制作的水 这种 现象是最常见的 建议用户更换 娃哈哈 纯净水 进样系统有残留很容易判断 建议加强或改善洗针程序