基因组印记与研究方法

1,基因组印记与研究方法,报告人 : cgl 2006年10月17日,2,主要内容,1 基因组印记与印记基因2 印记基因的特征3 可能的印记机制4 基因组印记与疾病5 基因组印记研究方法,3,1 基因组印记与印记基因,1 Genomic imprinting is a phenomenon in which alleles of a gene are expressed differentially depending on their parental origin. Those whose expression is dependent on the parental origin of the allele are known as imprinted genes.,4,印记基因中来自双亲的两条等位基因只有一个表达，另一个不表达或表达甚微。 母系印记：母本等位基因沉默（父本表达）的印记 基因称为母系印记基因。如：Igf2 ，Ins , Ndn. 父系印记：父本等位基因沉默的印记基因称为父系 印记基因。如：Cpa4, H19,Cd81.,5,目前在昆虫、植物、在真兽哺乳亚纲动物（eutherian mammals）和有袋类动物（marsupials）中发现了印记现象；而在单孔类（monotremes）和鸟类中没有发现印记现象。目前在小鼠和人上已经发现了100多个印记基因（印记转录单元）。见表 Back,6,2 印记基因的特征,2.1 印记基因常成簇存在。如印记基因Mash2、Ins、Igf2、H19位于染色体上不到400kb的范围内。如小鼠7号染色体 p57KIP2, KvLQT1 and Mash2-Insulin-2(Ins-2) and Igf2-H19。 人15号染色体： ZNF127 -SNRPN-IPW (encodes RNA) 。,7,2 .2印记基因复制的异步性。Igf2-H19区域的复制：父源等位基因复制早于母源等位基因。,8,2.3 染色体上基因印记的发生具有空间位置的限制性，同一条染色体上两个印记基因之间的基因、与印记基因相邻的基因通常不表现印记修饰。2.4 印记基因的发生常与该基因编码区、启动子区以及其上下游区域特定的CpG序列有关，这些特定序列的甲基化状态常影响亲本特异性。,9,2.5 基因印记的发生常有组织特异性和发育阶段特异性。2.6 基因组中存在印记维持元件，这些印记维持元件的缺失会导致部分印记基因印记的丢失。,10,a,2.7 印记基因在真兽哺乳亚纲动物保守。在小鼠中发现的印记基因一般在其他哺乳动物也表现印记特征，但少数基因例外（Cd81、Igf2r）。见表 Back,11,3可能的印记作用机制,3.1 DNA甲基化DNA甲基化是一种DNA结构修饰。它 一般和基因沉默相关联，去甲基化常和沉默基因的重新激活有关。DNA甲基化的转录调控可能参与哺乳动物基因组印记的产生。,12,在印记区域亲本等位基因一般存在甲基化差异，这些区域称为差异甲基化区（ differentially methylation region ，DMR）。DMR 在调控基因印记中起重要作用。,13,14,Igf2-H19 的印记机制: Igf2-H19 区域定位于小鼠7号染色体、人11号染色体。 Igf2 编码胎儿的一个生长因子，父本等位基因表达。 H19的转录物是功能未知的非编码 RNA，母本等位基因表达。,15,16,CTCF蛋白是一个锌指蛋白，结合到特定DMR上起绝缘子作用，这种作用具有位置依赖性。CTCF还介导interchromosomal association,(小鼠7号染色体的Igf2-H19和染11号色体的Wsb1-Nf1).这种interchromosomal association 可能参与基因组印记。,17,gene,gene,gene,gene,chromosome11,chromosome7,imprinting control region,imprinting control region-associated site,Wsb1,Igf2,H19,Nf1,CTCF,enhancer,other proteins,thranscription factors,?,?,transcription factory,18,3.2 乙酰化 组成核小体的组蛋白的不同氨基酸残基的乙酰化一般和活化的染色质构型和有表达活性的基因相关联。 H4组蛋白的乙酰化可能通过调节染色质的结构参与印记。,19,Igf2-H19 区域启动子区内H4的乙酰化水平在两条亲本染色体上存在差异，表达的等位基因比沉默的等位基因乙酰化水平高 。CTCF结合蛋白和组蛋白去乙酰化活性有关。,20,3.3 Micro RNA MicroRNA（miRNA）是指长度为2125nt的小型非编码RNA，由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体加工而成,通过抑制翻译或导致mRNA降解机制参与广泛的发育和细胞过程。 有些印记区域含有miRNA，参与印记的发生。如Dlk1-Gtl2 区域中antipeg11。,21,Dlk1-Gtl2 印记区域： 该区域位于小鼠12号染色体远端、人 14q32、绵羊18号染色体远端。 Dlk1, Peg11,Dio3 是该区域的蛋白编码基因，是Sushi-ichi 样逆转录因子的Gag、Pol的同源物。,22,23,4基因组印记异常与疾病,基因组印记异常常和各种发育紊乱和疾病相关，这些紊乱和疾病通常是由不正确的调节、剂量改变和突变造成的。印记基因的表达异常可能引起癌症、神经行为和发育异常，还能影响母性行为。 Back,24,5 基因组印记的研究方法,验证基因印记最基本的方法： Mat(AA) Fat(BB) F1(AB) RT-PCR-SSCP F1 （AB） 不印记 （A） 父系印记 （B） 母系印记,25,5.1 构建单亲二体型胚胎 利用核移植技术和细胞核融合（HVJ或仙台病毒辅助融合）生产单亲二体型胚胎，用以研究印记和发现印记基因。,26,5.1.1 孤雄胚胎（Androgenetic embryos AG ） 方法： 去核M期卵母细胞双精受精。 受精胚胎去雌原核，并用第二个精子来源的雄原核取代雌原核。 细胞核融合。 AG胚胎发育迟缓，相对于胚胎，胚外组织发育较好。,27,5.1.2 Parthenogenetic embryos (PG)一般常由未受精的卵母细胞获得。有些小鼠品系有很高的自发孤雌生殖率：如LT/SV品系、c-mos缺陷小鼠。 电激活 化学诱导：乙醇诱导（非整倍体） Sr2+诱导,28,5.1.3 Gynogenetic embryos (GG) 一般用原核移植方法。 GG和PG在发育潜能上几乎没有什么差异，所以用于PG的方法一般也可以用于GG。 但是，受精得到的雌原核与激活得到的雌原核是否是等价的还不清楚。PG和GG 胚外组织发育不良。,29,5.1.4平衡易位分析印记基因组区域 罗伯逊易位、相互易位和定向染色体重排 罗伯逊易位（图a）和相互易位（图b）杂合子杂交可以分别生产一条染色体或染色体片段UPD、单亲重复/缺失的小鼠。 平衡易位可以确定某个染色体或染色体片段是否含有印记基因。,30,Back,31,Back,32,定向染色体易位可以产生和罗伯逊易位相似的结果。可以在目的染色体区域定向产生插入、缺失、重复、相互易位。 利用Cre loxP重组酶系统进行基因打靶将染色体重排引入目的区域。,33,34,5.2 转基因技术研究印记控制区和控制元件小转基因载体研究印记的缺点：有时不能包括基因调控元件；易受染色体位置效应影响。YAC、 BAC、PAC等大的转基因载体容量大、拷贝数少，更能精确的表现目的基因的表达模式和表达水平。确定印记区域和印记区域内的印记调控元件。,35,YAC: 500-600kbBAC: 300kbPAC：P1-derived artificial chromosomes 300kb,36,Thanks,37,Back,38,ES细胞是囊胚内细胞团（ICM）的细胞培养物，ICM产生胚胎和胎盘的羊膜、卵黄囊、尿囊部分。囊胚注射实验表明ES细胞和ICM相似，但是二者不同。ES细胞可以被认为是ICM细胞：在体外外源性因子作用下，被停止在未分化的状态的某个细胞周期。,39,40,41,42,gene,gene,gene,gene,chromosome11,chromosome7,imprinting control region,imprinting control region-associated site,Wsb1,Igf2,H19,Nf1,CTCF,enhancer,other proteins,thranscription factors,?,?,transcription factory,43,5.1.4 利用ES细胞 ES细胞可用来研究基因组印记A ：是双倍体可以只含有母本或父本的两条染色体或染色体片段的单亲重叠。 B : retain imprints as assessed by the developmental potential of chimeras. C ：除了能提供体内嵌合体生产系统外还提供了一个未发育的胚体生产的未分化的体外分化系统。 D ：可以提供大量的细胞材料如进行染色质DNA的研究。 但是他们的分化和无限的分裂能力会导致表观遗传的改变。,44,5.3 Methylation-Sensitive Genome Scanning 一般印记domain内存在parental-allele-specific CpG methylation.所以寻找亲本等位基因特异性CpG甲基化有助于寻找印记基因。RLGS:restriction landmark genome scanning,45,5.4 实验验证印记基因的印记状况 一般有以下两种途径： 同一个基因在不同品系间有差异，进行种间互交。一般在小鼠上常用。 利用SNPs，不同个体间存在等位基因间的差异，然后这些个体进行杂交。利用杂交后代。,46,5.5 利用生物信息学方法预测印记基因 一般从DNA序列特征分析： 重复元件 转录因子结合位点 CpG岛,47,重复元件：一个基因侧翼的重复元件的数量、类型、相对方向对预测一个基因是否是印记基因非常重要。 有研究表明印记基因侧翼有低密度的短散布转座元