培养基的配制

培养基的配制 实验步骤 在超净台内 安装好滤器 用去离子水溶解 1640 培养基 并用磁力搅拌器搅 拌 2 h 使之充分溶解 在超净台内过滤 分装到 250 mL 的玻璃瓶内 用封口膜封好 20 保存 过滤结束时 还要取少许培养基进行菌培 验证培养基是否是无菌 胎牛血清的处理 没有灭活的血清中含有补体成分 需要将血清在 56 条件下灭活 30 min 在水浴锅内进行 灭活的过程中 要不停地摇晃 使受热均匀 防止沉淀析出来 注意 刚取出的冻存血清不要立即放入 56 中 因为突然的温度升高会使装血清的玻璃瓶 破裂 应该放在室温逐渐溶解 然后 再进行灭活处理 生长培养基的配制 90 mL IMDM 中加入大约 10 mL 的胎牛血清 10 左右 双抗可以不加 有资料表明双抗 对细胞有一定的毒副作用 Hanks 和 D Hanks 液 以及胰酶的配制 Hanks 液是一种常用的平衡盐溶液 D hanks 液是不含钙镁的 Hanks 液 它们与细胞的生长 状况下的 pH 值和渗透压一致 细胞在 Hanks 液中可生存几个小时 Hanks 液主要用于清洗 细胞 D Hanks 液主要用于配制胰酶 配制 Hanks 液需将 CaCl2 溶于蒸馏水 再将其它试剂配制成溶液 将两次配制的溶液混合 定容 胰酶是一种常用的细胞消化液 在原代培养时 用胰酶消化 使细胞从组织块中游离出来 传代培养时 用胰酶消化贴壁的细胞 并分散成单个细胞 胰酶分离细胞的能力与不仅与胰酶作用的温度 时间 浓度和 pH 有关 还与细胞的类型 和特性有关 用于原代培养消化组织块采用的浓度为 0 1 或 0 125 用于传代培养采 用的胰酶浓度为 0 25 或者 0 2 胰酶的配制 1 由于胰蛋白酶的作用主要机制是通过螯合钙镁离子 而钙镁离子是保持细 胞和细胞之间相互连接所必需的 所以 胰酶的配制用无钙镁的 D Hank 液 避免钙镁离子 干扰胰酶的活性 2 胰酶在 pH8 0 时活性最强 在过滤除菌前 须用 NaHCO3 干粉调溶液 的 pH 值 3 胰酶受热容易分解 所以避免盛夏配制 在配制过程中 温度保持在 4 最后 20 冻存 反复冻溶会影响胰酶的活性 要分装冻存 4 血清能降低胰酶的活性 所以 在终止胰酶的消化反应时 可加入含有血清的培养基 实验步骤 配制 Hanks 液 高压灭菌 4 保存 称取胰酶 在冰浴上进行研磨 并加入少量的 D Hanks 液 使其呈糊状 最后用 D Hanks 定容 过滤除菌 分装后 20 保存 实验三 细胞传代培养 实验步骤 1 准备工作 1 肥皂洗手 在进行无菌操作前 用 75 的酒精擦拭双手 注意指间 和 指甲周围 同时 用酒精棉球擦拭超净台 2 将培养液放置室温 备用 3 打开超净台 内的紫外灯 照射 20 min 同时 将实验所需材料也放入超净台进行灭菌 血清 培养基 除外 4 倒置显微镜下 观察细胞的状态 是否已经长满培养瓶 需要进行分瓶 2 关闭超净台的紫外灯 打开风机 3 点燃酒精灯 取出刻度吸管 在火焰上略烧 然后 安上吸球待用 4 在打开培养瓶之前 用酒精棉球擦拭瓶盖 打开后 瓶口在酒精灯上过火焰 再用吸管 轻轻吸出旧的培养液 注意 吸管不要碰到布满细胞的培养瓶的侧壁 5 将胰酶加入培养瓶内 显微镜下随时观察 见到细胞的突起消失 变圆时 立即翻转培 养瓶 吸出胰酶 记住不要消化时间过长 否则 细胞会被胰酶消化掉 6 加入适量 Hanks 液或培养基清洗一遍 立即倒掉 7 加入含有 10 血清的培养基 用吹打管吹打 一定要轻轻吹打 使其从瓶壁上脱落分散 到培养基中 再补加培养基 按 1 3 进行分瓶 然后 用火焰烧培养瓶的瓶口和盖 再盖 好培养瓶的盖 放到培养箱中进行培养 以上介绍的是贴壁细胞的传代培养方法 对于悬浮细胞的传代培养方法 只需要将细胞进 行离心 1000 rpm 5 min 然后 换入新的培养基即可 再分装到不同的培养瓶中进行培养 不健康的细胞质中有空泡 细胞内有颗粒样物质 细胞间空隙增大 变形 不规则 失去 原有的特点 4 是否污染 传代或换液 24 48 h 注意观察细胞是否被污染 污染的细胞培养液变浑浊 镜下可见有大 量菌丝 如果细胞生长缓慢 生长特性改变 胞质内颗粒性物质增多 尽管培养液不变浑 浊 考虑可能有支原体污染 污染的细胞立即从培养箱中取走 以免污染其它细胞 实验四 细胞冻存与复苏 实验步骤 1 为了保证细胞良好的状态 在细胞冻存的前一天使细胞处于对数增长期 同时将细胞换 液 次日 按照细胞传代培养方法 用胰酶消化贴壁细胞 将细胞用培养基冲下来 然后 用 50 mL 尖底离心管离心 1000 rpm 4min 弃上清 收集细胞 2 加入适量的冻存液 10 DMSO 和 90 含有 20 血清的 IMDM 培养基 3 分装到冻存管中 做好标记 标明细胞名称 保存时间 所用培养基等 4 4 放置 30 min 20 放置 1 5 h 70 放置 12 h 最后移到液氮罐中 细胞的复苏 细胞的复苏原则是快速溶化 因为如果缓慢的溶化 会使进入细胞的水分形成冰晶