实验三血标本的微生物学检验

实验三,血标本的微生物学检验,实验目的：掌握血液标本的采集与处理、常见病原菌及一般微生物学检验程序。掌握葡萄球菌及链球菌的鉴定方法；熟悉它们的生物学性状。,血液标本的采集与处理：血液标本应在病人发热12日或发热高峰采集培养为宜。此时阳性率高。采血培养应该尽量在使用抗菌药物之前进行，从不同部位采集血液标本，做2次血培养；心内膜炎急性病例，在抗生素治疗前，从不同部位采血3次做血液培养；亚急性心内膜炎病例，第一天24h内，相隔1h连续采集3次血标本培养，若2448h全部阴性，再采集23次血标本培养。对间歇性寒战或发热应在寒战或体温高峰到来之前0.51h 采集血液，或于寒战或发烧后1h进行。,入院前两周内接受抗菌药物治疗的患者，连续3d，每天采2 份。（如果病人曾服用磺胺类药物，应在每50 ml 培养基内加对氨苯甲酸2.5 mg ， 以防止磺胺类药物对细菌的抑制作用。如果病人已用青霉素治疗，应在培养基中加入青霉素酶100 U50 ml （青霉素酶不耐热，应在临用时加入）。若病人已用其他抗生素治疗时，可用硫酸镁肉汤增菌。）采集时应以无菌手续由静脉取血510ml，儿童15ml，立即注入适当的液体增菌培养瓶内（培养基与血液的比例为10:1），并迅速轻摇，使充分混匀，以防凝固，并有利于细菌生长。（疑似细菌性心内膜炎时，以肘动脉或股动脉采血为宜）,作厌氧菌培养时，抽血后应立即接种厌氧培养基中，避免接触空气，并尽快送往细菌室放入温箱，避免温度对细菌生长不利。采血后应该立即送检，如不能立即送检，可室温保存（25 ），切勿冷藏。采血和接种时应严格注意无菌操作，避免污染杂菌。培养对营养要求较高的细菌用肝浸液或胰胨肉汤等。同一份血液标本，必须同时做需氧和厌氧培养。,常见病原体：,检验程序：血标本（无菌采集） 增菌培养硫酸镁葡萄糖肉汤（需氧培养;如检测沙门氏菌用胆汁葡萄糖肉汤，如检测厌氧菌用硫乙醇酸钠肉汤） 观察细菌生长情况直接涂片染色 分离培养 直接药敏试验,需氧培养（BA） CO2培养（CA） 厌氧培养（BA）,观察菌落形态、涂片染色镜检,血清学鉴定 生化鉴定 药敏试验,确定病原菌,发报告,接种于增菌肉汤培养基后，立即置35 1 温箱内孵育，每天取出一次观察有无细菌生长，应特别注意观察肉汤内有无混浊、沉淀、菌膜、色素、血液变色、指示剂变色等现象，并记录之。连续观察7天。35 1 温箱内孵育1218h后，在BA或CA上盲目传种一次，如无菌生长继续培养到第7天，取出后接种于BA，再在BA或CA上盲目传种一次经培养仍无细菌生长，可报告为：“经7天培养无细菌生长”。对于亚急性心内膜炎病人标本，应培养1个月，才能得出结论。（可疑布鲁菌培养28天，可疑军团菌培养10天）,如有菌生长，增菌肉汤会呈现不同生长现象，若发生浑浊，多为G-杆菌；若均匀浑浊有绿色荧光，则可疑为绿脓杆菌；上面澄清，下面有沉淀，可疑为链球菌；若见自下而上的溶血现象，可疑为溶血性链球菌；若呈现肉冻样凝固现象，疑为葡萄球菌；若表面有灰色菌膜，疑为枯草杆菌或类白喉杆菌。,目前L 型菌感染败血症亦有报告，主要是由于使用抑制菌细胞壁合成的抗菌药物（青霉素G 、氨基苄青霉素、苯唑青霉素、先锋霉素、万古霉素和环丝霉素等）治疗过程中，失去细胞壁的菌体继续繁殖感染所致。因此，结合临床，在多次培养无菌生长的情况下要考虑L型细菌感染.,检验程序： 革兰阳性球菌 触酶 + - 葡萄糖发酵 链球菌属 + - + - + - S R,玻片凝固酶 微球菌,金黄色葡萄球菌 试管凝固酶,金黄色葡萄球菌 新生霉素敏感,表皮葡萄球菌 腐生葡萄球菌,实验器材：1、标本：已增菌模拟血液标本1#、2#、3#、4#。2、培养基：BA、高盐甘露醇平板。3、试剂：生理盐水、3%过氧化氢、人血浆、10万单位溶于pH7.4 0.05M磷酸盐缓冲液的青霉素、0.05%溴麝香草酚兰溶液、产内酰胺酶阳性菌（金黄色葡萄球菌）和阴性菌（柠檬黄色葡萄球菌）、革兰染色液等。,实验方法：一、分离培养 用无菌方法将已增菌模拟血液标本1#、2#、3#、4#分别划线接种于血平板上，置35培养1824小时。二、直接涂片染色 取上述1#、2#、3#、4#标本分别作涂片、革兰氏染色、镜检。（要求绘图并描述）,三、结果观察1、菌落形态描述： 1#标本： 2#标本： 3#标本： 4#标本：2、菌体形态观察： 分别取1#、2#、3#、4#标本的血平板培养物涂片、革兰染色、镜检。 。（要求绘图并描述）,四、鉴别试验1、触酶试验（过氧化氢酶试验）：原理：葡萄球菌产生的触酶（过氧化氢酶），能催化过氧化氢分解成水和初生态氧，继而形成氧分子出现气泡。方法：用接种环挑取待检菌菌落，置于洁净载玻片上，滴加3%H2O2溶液1滴，1分钟内观察结果。结果判断 阳性：产生大量气泡。 阴性：不产生气泡或缓慢产生少量气泡。意义：本试验用于鉴别葡萄球菌和链球菌，前者为阳性；后者为阴性。注意事项：1、本试验不适宜用血平板上的菌落，因红细胞内含有此酶，会出现假阳性。2、应使用新鲜培养菌，因陈旧培养物可失去酶活性。3、H2O2浓度过高，产生假阳性。,2、血浆凝固酶试验：（葡萄球菌属细菌属内鉴别试验）原理：金黄色葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可使血浆中的纤维蛋白原变为不溶性纤维蛋白，附着于细菌表面，在玻片上形成凝块；也可使试管中的血浆发生凝固。玻片法：取兔或人血浆及生理盐水各一滴（或用接种环取12环），分别滴于洁净载玻片上，用接种环从血平板上挑单个菌落，分别与血浆和生理盐水混合，观察结果。结果判断 阳性：被检菌与血浆产生颗粒性凝集而与生理盐水不产生凝集。 阴性：二者均不凝集。意义：血浆凝固酶试验是鉴定致病性葡萄球菌和非致病性葡萄球菌的重要试验之一，前者多为阳性，后者为阴性。,五、生化鉴定1、葡萄球菌鉴定： 将1#、2#、3#、4#标本中葡萄球菌划线接种于高盐甘露醇平板上，置35培养1824小时。原理：葡萄球菌属细菌能耐高盐（2.5%氯化钠），且致病性葡萄球菌多能发酵甘露醇产酸，使培养基由红色变为黄色（高盐甘露醇平板的指示剂为酚红）。结果判断 阳性：培养基由红色变为黄色。 阴性：培养基仍为红色。意义：致病性葡萄球菌可呈阳性，非致病性葡萄球菌为阴性。,2、链球菌鉴定： 将1#、2#、3#、4#标本中链球菌划线接种于七叶苷斜面、6.5%NaCl肉汤培养基上，置35培养1824小时。1）七叶苷分解试验原理：肠球菌能水解七叶苷，生成葡萄糖和七叶素，七叶素与培养基中的枸橼酸铁的Fe3+起反应，形成黑色沉淀，使培养基变黑色。结果判断： 阳性 培养基变黑色。 阴性 培养基不变。意义： 此试验是鉴定肠球菌和其他链球菌的重要试验。肠球菌为阳性，其他链球菌为阴性。,2）6.5%NaCl生长试验：原理：肠球菌具有很强的耐盐能力，能在65%NaCl血清肉汤培养基中生长呈浑浊。结果判断： 阳性 血清肉汤浑浊生长。 阴性 血清肉汤透明。意义： 此试验是鉴定肠球菌和其他链球菌的重要试验。肠球菌为阳性，其他链球菌为阴性（即耐盐能力较弱，不能在此培养基上生长）。,六、药敏试验内酰胺酶检测原理：内酰胺酶是主要由金黄色葡萄球菌和淋病奈瑟菌等所产生的抗菌素灭活酶。它能裂解青霉素类和头孢菌素类抗生素的基本结构内酰胺环，从而使其丧失抗菌活性。细菌产生的内酰胺酶可将内酰胺类抗生素降解成酸性产物。pH指示剂检测溶液pH变化即可知细菌对内酰胺类抗生素的敏感性。方法：1、取3支小试管，各加10万单位青霉素溶液0.05ml。2、分别用接种环挑取内酰胺酶阳性对照菌、阴性对照菌和待测菌的菌落数个于上述3支小试管中，制成浓稠菌悬液，37水浴1小时。3、分别加入1小滴溴麝香草酚兰指示剂于试验菌液中，观察颜色变化。结果判断： 阳性菌：溴麝香草酚兰指示剂呈黄色。 阴性菌：呈绿色。注意事项：1、试验菌必须是新鲜菌，细菌培养时间过长，酶失去活性，试验出现假阴性。2、细菌悬液一定要非常浓，否则为阴性结