厌氧菌的分离和鉴定

厌氧菌的分离与鉴定,卫生部北京医院陈东科,厌氧菌检验是临床微生物检验的重要组成部分。在无氧（或少氧）条件下，或氧化还原电势低的条件下才能繁殖的细菌称为厌氧菌。因为厌氧菌在人体肠道、口腔、泌尿生殖道正常菌群中占优势，所以当人体菌群失调时，厌氧菌可能侵犯人体许多部位，发生严重的甚至致死的内源性厌氧菌感染。厌氧菌感染常发生在深部伤口, 但也可伴兼性厌氧菌和需氧菌侵犯人体任何器官和组织。所以，对厌氧菌检验应给予高度重视。,人体各部位厌氧菌寄生量及其与需氧菌之比,_厌氧菌数量 眼结膜 鼻涕 唾液 牙表面 牙周袋与牙垢 _（cfug） 1034 1014 1089 10910 101112 厌氧菌与需氧菌之比 10:1 10:1 810:1 1:1 1000:1 _厌氧菌数量 胃液 结肠 小肠 阴道 外尿道 皮肤_ （cfug） 1025 101112 1046 1089 1035 1034厌氧菌与需氧菌之比 1:1 1000:1 1:1 10:1 10:1 10:1_,1.正确地选择标本,下列细菌学指征有助于选择标本做厌氧培养：（1）深部伤口或软组织脓肿的脓，特别是伴有恶臭或含有硫磺颗粒时。（2）可疑为气性坏疽或少见的严重产气或坏死性感染所取得的坏死组织或病灶清除材料。（3）粘膜部位的感染灶取得的材料。（4）从脑、肺、肝或其他器官的脓肿或从腹腔内、肛周、隔下或其他部位的脓肿取得的材料。,（5）无菌区感染灶的吸出液(包括血液、脑脊液、腹水、胸水、滑膜液、羊水等)。（6）人或动物咬伤感染灶取得的材料。（7）变黑的或置于紫外线发红色荧光的渗出物。（8）革兰染色，镜下见到具有厌氧菌独特形态的材料。（9）可疑引起肉毒杆菌食物中毒的食物。,2.正确地收集标本,厌氧菌是人体许多部位（如皮肤、口咽部、肠道和泌尿生殖道）正常菌群中的一部分，因此下列材料无需做厌氧培养：（1）咽、鼻、尿道或直肠拭子。（2）咳出的痰，通过支气管镜取的分泌物，排出或导出的尿、粪及胃内容物。,为排除或尽量减少正常菌群中厌氧菌的污染，用注射器抽取标本比用拭子更好，特别适用于下列临床情况：（1）从未开放的脓肿抽取脓液。（2）通过胸腔穿刺抽出的胸腔液。（3）从耻骨联合上方做膀胱穿刺吸出或从肾造口管收集的尿。（4）气管切开吸取的肺分泌物。,（5）穿刺抽出的腹腔液。（6）通过腰椎穿刺抽出的脑脊液。（7）窦道标本可插入小导管用注射器吸出，注射器和针头内的气体应全部排出，将其内容物直接注入一个已排出气的无菌试管内。也可自窦道损伤部位取材做活组织检查。如果必须使用拭子，应尽快接种于适宜的培养基中。,3. 正确地运送标本,临床标本一旦离开人体部位，在进入厌氧环境前，必须防止大气中氧的毒性作用。应及时将取材的拭子、塑料导管内的少量液体、吸入注射器的标本装入厌氧生物袋或管，在运送过程中要保持厌氧状态。培养基内不应含有肝素，因它会抑制细菌生长。,4. 使用新配制的培养基,初代接种厌氧菌最好使用新配制的培养基。 平板培养基无需在厌氧条件下贮存，用前可进行预还原，但厌氧条件下贮存可延长培养基的有效期。,5. 提供可靠的厌氧环境,使用厌氧罐法、厌氧袋法或厌氧箱法。在厌氧培养中必须使用氧化还原指示剂，一般采用亚甲基美兰或刃天青，每次要新鲜配制。如果能在孵育的整个过程中维持厌氧条件，指示剂溶液将无色，否则指示剂则变色。,6. 标本接种与孵育,（1）拭子和液体标本直接接种固体和液体培养基（需氧和厌氧培养各一份），在厌氧平板上贴一片灭滴灵纸片（5g/片），置35培养。同时做直接涂片革兰染色镜检。用铂-铱合金环（不用镍-铬合金环，因为它可氧化接种物）三区划线接种平板，以保证长出单个菌落。 （2）若被检标本是组织块，则立刻将其移入无菌的组织研磨器内，用硫乙醇酸盐混合研碎，最好在厌氧箱内或无氧条件下操作。组织匀浆接种同液体标本。（3）可疑含有芽胞梭菌的标本，还要用乙醇或加热处理后再行接种。,7. 直接涂片检查,当有足够的标本或收到两个拭子时，最好在接种前做涂片革兰染色镜检，检查结果可提示需要接种哪些培养基（非常规使用的）。涂片检查可看出有无细菌，微生物的类型和大概的数量以及芽胞、形状和位置（芽胞梭菌）、着色情况及菌体特征。对血性液体或浓稠分泌物用丫啶橙染色比革兰染色较易观察。这些初步结果应该及时向主管医生报告，以帮助他们正确选用抗菌药物。涂片检查可核对培养结果是实验室质量控制的一个重要指标。,8. 厌氧菌鉴定,（1）灭滴灵纸片周围出现抑菌环说明有厌氧菌生长（绝大多数专性厌氧菌对灭滴灵敏感，兼性厌氧菌耐药）。（2）耐氧试验：接种BRBA平板（需氧厌氧各放一块）及巧克力平板（置CO2条件下）。（3）革兰染色：根据菌落和菌体形态、染色特性可初步鉴定。（4）抗生素敏感性鉴定：BRBA平板上分区划线接种，第一划线区贴多粘菌素（10g/片）、卡那霉素（1000g/片）和万古霉素（5g/片）。厌氧菌纯培养抑菌环直径=10mm为敏感。,表1 级水平实验室革兰阴性厌氧菌群、属、种鉴定,_厌氧菌种类 细胞 卡那 万古 多粘 20% 靛基质 脂酶 硝酸盐 尿素酶 动力 凹痕 砖红色 形态 霉素 霉素 菌素 胆汁 还原 荧光_脆弱类杆菌群 B R R R + V 其他类杆菌 B R R V V + 产色素杆菌. R V V V V P.中间型杆菌 CB/B R R S + +- +- P loescheii R R V +类解脲类杆菌群 S R S + V V V 解脲类杆菌. B S R S + + V梭状肛菌属 S R S V V V 革兰阴性球菌 C S R S V韦荣球菌属 C S R S + +_ R:耐药，S:敏感，V:不定，C:球菌，B:杆菌，CB:球杆菌，P:Prevotella;*甲酸、延胡素酸盐刺激生长阳性,表4-3 级水平实验室革兰阳性厌氧菌群、属、种鉴定,_厌氧菌种类 细胞 已醇芽 卡那 多粘 万古 靛基质 硝酸盐 触酶 卵磷 反向CA 菌体列车 双环 尿素酶 形态 胞试验 霉素 菌素 霉素 还原 脂酶 MP试验 状排列 溶血现象_厌氧革兰阳性球菌 C V R S V 厌氧消化球菌 C/CB RS R S + V 不解糖消化球菌 C S R S + 梭状芽胞杆菌属 B + V R S V奈格尔试验阳性梭芽胞菌 B + S R S + 产气荚膜梭菌 B + S R S + + + + 双酶梭菌 B + S R S + 索氏梭菌 B + S R S + +奈格尔试验阴性梭芽