脑心肌炎病毒感染神经细胞的基因表达谱分析.doc

脑心肌炎病毒感染神经细胞的基因表达谱分析 畜牧兽医学报2019,50 (8)$7091714ActaV&t&rinaria&tZoot&chnicaSinicadoi:10.11843/j.issn.0366-6964.2019.08021脑心肌炎病毒感染神经细胞的基因表达谱分析李丽敏，邹云S郝雪飘S赵兴华1!,李睿文1!,孙继国1!袁万哲(1.河北农业大学动物医学院，保定071001；2.河北省兽医生物技术工程技术研究中心，保定071001)摘要脑心肌炎病毒(EMCV)可感染人和多种动物。 为了探索EMCV对N2a细胞转录组的影响，揭示基因表达与致病性之间的关联，本研究用EMCV BD2毒株感染N2a细胞，收集感染后7h的细胞样本，提取总RNA,使用NimbleGen杂交体系将标记好的ds-cDNA与小鼠基因表达谱芯片杂交，对芯片进行扫描，获得差异表达基因数据&应用生物信息学方法对筛查出的差异表达基因数据进行分析，筛选差异表达的免疫相关基因及信号通路；利用re al-time FQ-PCR方法，对微阵列数据结果进行验证。 结果表明，EMCV感染N2a细胞后共有21143个差异表达基因；通路分析表明，差异表达的主要信号通路包括PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、细胞因子间相互作用、趋化因子信号通路、TCR/RLR信号通路和细胞凋亡通路等;Real-time FQ-PCR检测的10个差异表达基因的变化情况与通过微阵列分析预测的变化一致。 关键词脑心肌炎病毒；基因表达谱；N2aS852.659.6文献标志码:A0366-6964 (2019)08-1709-06Analysis onGene ExpressionProfiling inNerve CellsInfected byEncephalomyocarditis VirusLI Limin1,2,ZOU Yunjing1,HAO Xuepiao1,ZHAO Xinghua1,2,LI Ruiwen12!SUN Jiguo12!YUAN Wanzhe12(1.College ofAnimal Medicine,Agriculture Universityof Hebei,Baoding071001,China&2.Hebei Engineeringand TechnologyResearch Centerof VeterinaryBiotechnology,Baoding071001!China)Abstract:Encephalomyocarditis virus(EMCV)can infecthumans andmany animals.This ge-nome-wideexpressionprofilecouldcontributetoexploringtheassociationbetweengeneexpres-sionandpathogenicity!andrevealingthemolecularmechanismafterinfection N2ace lswerein-fected usingEMCV BD2strain Thece ls wereco lected7hours afterinfection!total RNAwas extractedfrom EMCVinfected group and normalcontrol group!respectively Microarrayswere hybridizedwithlabeledds-cDNAinaNimbleGenHybridizationSystem Fol owinghybridization!washingwasperformed Afterbeingwashed!theslideswerescanned Thedataofthedif erenti-a lyexpressedgenesobtainedfromscanningwereidentifiedandanalyzedbyapplyingbioinformat-icsmethod Real-timeFQ-PCR wasperformedtocorroboratetheresultsobtainedwiththe microarrayanalysis Theresultsshowedthatatotalof21143geneswereidentifiedasdi f erentia ly expressedgenesat7hoursafterEMCVinfection Thesegenesareinvolvedinmanyvitalfunc-tionalclasses!includingimmuneresponse!inflammatoryresponse!apoptosis!defenseresponse!2019-01-27基金项目河北省自然基金项目(Cxx204191)河北省高校百名优秀创新人才支持计划(SLRCxx039)；河北省现代农业产业技术体系羊产业创新团队专项资金(HBCT2018140204)作者简介李丽敏(1982-,女，河北元氏人，博士，副教授，主要从事预防兽医学教学与科研工作,TeE-mail:lilimin03163通信作者袁万哲，主要从事预防兽医学教学与科研工作,TeE-mailyuanwanzhe126.1710畜牧兽医学报50卷signaltransduction Andthediferential yexpressedgenesassociatedwithinterferonweresignif-icantly up-regulated,suggesting thatinterferon playsan importantrole inhost antiviralinfection.Thepathway analysisdemonstratedthatthe mostsignificant pathwayswere associatedwith PI3K-Akt signalingpathway,MAPK signalingpathway,chemokine signalingpathway,cyto kine,TLR,TCR,RLR andJak-STAT signalingpathway Theseresultsindicatethatthehostinitiates adifferent strategyto activateimmunological andinflammatory reactionto fightinfection afterEMCV infection.The changesof10differentially expressed genes detectedby Real-timeFQ-PCR wereconsistent withthose predictedby microarrayanalysis.Key words；encephalomyocarditis virus;gene expressionprofile;N2a脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)能引发猪脑炎、心肌炎和母猪繁殖障碍，并能通过猪器官移植感染人，严重危害养猪健康与公共卫生安全。 EMCV属微RNA病毒科(Pzcorna-viridae)心病毒属(Cardiovirus)成员，其为单股正链RNA病毒，基因组全长约7.8kb,含有一个大的开放阅读框架(ORF),编码相对分子质量约为2.6X103ku的多聚蛋白10自从1958年从患心肌炎的病猪中分离到EMCV以来2，世界上一些养猪国家都曾有该病的发生、流行34以及EMCV感染5的报道，给养猪业造成了一定的经济损失。 我国从病原学和血清学方面已经证实在不少养猪生产地区的规模化猪场存在EMCV的感染67,对养猪生产潜在的危害受到关注。 xx年，美国疾病控制中心(CDC)从南非急性发热病人中分离到EMCV,并从恢复期病人血清中检到抗体,其公共卫生意义也值得引起重视。 项目组成员自xx年以来，在EMCV抗原抗体检测方法的建立、流行病学调查、病原分离、基因组结构以及致病机制等研究方面已经取得了一定进展卩3，但关于该病毒与宿主细胞相互作用的分子致病机制尚不清楚。 基于此，本研究拟采用基因表达谱芯片技术，探索EMCV感染N2a细胞后基因表达谱变化，揭示EMCV感染的分子机制，为进一步阐明EMCV与宿主的相互作用提供线索。 1材料与方法1.1细胞与毒株小鼠神经母细胞瘤细胞N2a购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。 本试验中采用的EMCVBD2(GenBank；KF709977)由本实验室分离并保存。 1.2基因芯片Roche NimbleGen12X135K小鼠基因表达谱芯片涵盖了44170个基因，这些基因均于包括NCBI在内的权威数据库；每张芯片可以同时杂交12个样品。 1.31.3.1样本采集用EMCV感染N2a细胞，于37C,5%CO细胞培养箱中培养7h,同时设立对照。 加入TRIzol LSReagent提取试验组与对照组总RNA。 1.3.2芯片杂交利用T7-oligo(dT)引物合成双链cDNA,纯化后转录为cRNA,再反转录为cRNA,用Cy3-dCTP标记cRNA,42C将标记好的探针与高密度基因组芯片进行杂交。 1.3.3图像采集与数据分析使用芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度，并将试验结果转化成数字型数据保存,使用软件对原始数据进行分析运算,寻找差异表达基因。 1.3.4实光定PCR验证数用SYBR GreenI荧光染料，在RNA水平上对其中10个差异表达基因进行实时荧光定量PCR(Real-time FQ-PCR)验证。 根据GenBank中收录的相应基因序列，设计了11对荧光定量PCR引物(见表1)。 22.1散点图分析如图1所示，图中红色点代表表达上调大于2倍的差异表达基因，即上调表达基因，共6137个;绿色点达于a2倍的达，调表达基因，共5829个；黑色点表示无明显差异表达变化的基因。 8期李丽敏等脑心肌炎病毒感染神经细胞的基因表达谱分析1711表1实时荧光定量PCR的检测引物Table1Primers usedfor Real-time FQ-PCR基因登录号GenBankaession No名Genename引物53Primers sequence(53AK016078CD247F:TCATCTACGGAGTCATCATCACAGR:GTAGGCTTCTGCCATCTTGTCTTAK213273CDC37F:GGCCATGAAGGAATATGAAGAGR:CTCAGGCAGGGATTCGTAGACBC024392CXCL5F:CATTTCTGTTGCTGTTCACGCR:ACTTCCACCGTAGGGCACTGBC030067CXCL10F:TCTCTCCATCACTCCCCTTTAR:GCTTCGGCAGTTACTTTTGTCBC052217IFNAR1F:CTGGTTTGGTAACGCTGTACGGR:TGAAAGGCCACCCATAGATTGTAK157245IL邛F:CTTCAGGCAGGCAGTATCACTCR:GCAGTTGTCTAATGGGAACGTCAK152189IL6F:ACCACGGCCTTCCCTACTTCR:CTCATTTCCACGATTTCCCAGBC031424ISG15F:TGTCCGTGACTAACTCCATGACR:GACCTC ATAGATGTTGCTGTGGBC046754NFKBIA F:TTGGCAATCATCCACGAAGR:TCTGCGTCAAGACTGCTACACTBC117057TNFF:GAGTCCGGGCAGGTCTACTTTR:CAGGTCACTGTCCCAGCATCT-actin F:GTACCACCATGTACCCAGGCR:AACGCAGCTCAGTAACAGTCC(puz二&UIJOU)AOWK(芒SSIL)A OW B16?Up-regulation (6137)?Down-regulation (5829)?Not differentialexpressed (31048)6810121416N2a(已标准化)N2a(normalized)图1基因差异分析散点图Fig.1Scatter diagramof differentialexpressedgenesof experimentalgroupandcontrol group1712畜牧兽医学报50卷2.2生物信息学分析2.2.1GO分析使用标准富集分析方法对6137个上调和5829个下调差异表达基因的分子功能、生物学过程以及细胞组分进行标准富集分析。 其中，与免疫、炎症反应相关的上调基因过表达，表明这些基因在EMCV感染过程中发挥着重要作用。 在这些基因中，23个差异表达基因上调超过5倍,9个差异表达基因上调超过10倍。 2.2.2KEGG通路分析为了深入了解EMCV感染N2a细胞7h后与感染相关的不同生物学过程，使用KEGG数据库对上调组6137个差异表达基因和下调组5829个差异表达基因进行Pathway分析。 在病毒感染宿主细胞7h后，所涉及到的主要途径包括PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、细胞因子间相互作用、趋化因子信号通路、T细胞受体信号通路、RIG1样受体信号通路、细胞凋亡信号通路、TRP通道的炎症介质调节、泛素介导的蛋白水解通路。 结果表明，在感染病毒7h后，宿主启动不同策略来激活免疫、炎症反应以对抗感染。 2.3差异表达基因的real-time FQ-PCR验证为了证实微阵列数据统计的显著性，本研究中选择7个上调基因（CD 247、CDC 37、CXCL 10、IF-NAR 1、IL1#、IL 6、NFKBIA）、3个下调基因代乂-CL 5、ISG 15、TNF）进行real-time FQ-PCR检测，结果见表2。 结果显示$0个基因表达水平的变化情况与通过微阵列分析预测的变化一致。 表2通过real-time FQ-PCR验证微阵列结果Table2Validation ofmicroarray resultsby real-time FQ-PCR基因登录号P值cP valuecGenBank aessionNo基因名祢Gene微阵列FC aMicroarrayFCa实时荧光定量PCRReal-time FQ-PCR FCAK016078CD2474.55982884.48367.189179X1&AK213273CDC377.0048996.34373.9&218X1&-BC024392CXCL5a2.885445-0.167b2.57&26X1&-BC030067CXCL105.28622164.7431.55485X1&-BC052217IFNAR12.1434321.9954.&8346X1&-AK157245IL1#4.45901144.1681.&5282X1&-AK152189IL617.777181417.3561.18&6&X1&-BC031424ISG15a3.4850673-&.293b3.6&341X1&-BC046754NFKBIA2.48559872.2441.86338X1&-BC117057TNFa11.1039165-&.1&5b3.74699X1&-a.倍数差异；b下调基因组&.对特定基因进行real-time FQ-PCR的差异表达的显着性水平aFoldchange&bDownregulatedgene&cSignificancelevelofdi ferentialexpressionforaparticulargeneviareal-timeFQ-PCR3讨论1969年，Klebe和Ruddle通过A株小鼠的自发性肿瘤建立N2a细胞，该细胞具有易转染且能够大量表达微管蛋白等特点，目前已被广泛应用于神经细胞分化及信号通路研究领域14。 高通量cD-NA微阵列技术是分析病原体与宿主细胞之间相互作用的有效工具，该技术可以有效识别宿主细胞被病原体感染后基因表达的变化情况。 通过芯片杂交、数据分析可寻找海量差异表达基因，特异、敏感、省时、省工，同时也可大大减少利用实时荧光定量方法寻找差异表达基因时的漏检问题。 李彬等15利用基因表达谱芯片检测PRRSV/Mhp共感染PAM后基因表达变化,感染后6和15h分别有2152与1760个差异基因，包括炎症反应、免疫反应、细胞凋亡、防御反应、信号转导方面，涉及到的主要信号通路有信通路，、TLR、RLR和NLR信号通路以及Jak-STAT信号通路。 该项技8期李丽敏等脑心肌炎病毒感染神经细胞的基因表达谱分析1713术为进一步研究病原与宿主相互作用提供了新的线索。 鉴于此，本研究应用基因芯片技术探索了EM-CV感染N2a细胞的基因表达谱变化情况，对差异表达基因进行了聚类分析、GO分析以及KEGG Pathway功能分析，并经real-time FQ-PCR对微阵列数据的分析结果进行验证，揭示了感染后的致病机制及免疫机制，也为EMCV与其宿主细胞间相互作用的研究提供了理论依据。 结果表明，在EMCV感染过程中，超过20000个基因为显著差异表达，这些差异表达基因从属于多种功能类别和信号途径。 已有的研究表明，促炎细胞因子的产生、炎症反应和免疫应答是影响EMCV致病作用的重要因素)16*。 EMCV的致病性取决于病毒和宿主两方面因素，所有这些数据表明，宿主免疫系统的激活在EMCV发病机制和免疫机制中起重要作用。 在本研究中，使用cDNA微阵列分析与EMCV感染相关的炎症反应基因表达模式，发现参与炎症反应的大量基因(例如IL1#、IL 6、IL 10、CCL 2、CCL4)在EMCV感染后上调至不同程度。 此外，发现参与T细胞受体信号通路有34个基因,PI3K-Akt信号通路有87个基因，MAPK信号通路有66个基因,RIG-1样受体信号通路有21个基因，细胞凋亡信号通路有22个基因，趋化因子信号通路有52个基因，TRP通道的炎症介质调节有32个基因。 与白细胞介素相关的基因(如IL邛、I L 6、I L 10、IL18等)差异表达量不一，但均有明显的上调。 其中,IL-1作为强协同刺激因子，具有诸多生物学活性，包括促T细胞活化、促进增殖与分化，增强自然杀伤细胞的杀伤活性，诱导细胞毒性T淋巴细胞产生等。 IL1还可诱导活化上皮细胞,从而对中性粒细胞产生刺激，促进炎性介质释放。 IL10的主要生物活性为免疫抑制，IL18主要作用是诱导细胞增殖、介导细胞的免疫反应。 而IL1#作为参与多种通路的促炎细胞因子,其在炎症反应中起关键作用。 在目前的研究中，上调基因编码的大量分子与IL1#相互作用，同时，KEGG通路分析表明IL1#参与多种途径，包括细胞因子间相互作用,MAPK信号通路和TNF信号通路等。 研究表明！L1#通过募集免疫细胞参与炎症反应，且与许多炎性疾病的病理生理学相关)17*。 在本研究中，CXCL10上调超过5倍，研究CXCL10在多种病中与免疫反应有多种生物学功能，主要表现在介导Th1型炎症反应，加快反应进程，趋化T细胞，对Th2反应进程造成破坏18?与干扰素相关基因的表达均有明显的上研究发现素节BRF 3、FNAR1在7h即有明显的上调表达，干扰素效应基因(如OAS、PKR、MT等基因)转录上调。 OAS是2,5-寡腺核昔酸合成酶(2，5-oligoadenylate synthetase，OAS)，它能够在dsRNA和ATP的存在下合成2，5-寡腺核昔酸，这些小单位的核昔酸能够激活RNA内切酶从而引起细胞和病毒RNA的降解)19*。 研究发现EMCV感染N2a细胞后，OAS在感染7h表达上调，认为EMCV感染后诱导出高水平IFN，使OAS表达增加，从而发挥抗病毒作用，抑制EMCV在N2a中的复制增殖。 因此，干扰素在宿主抗EMCV感染过程中发挥重要作用。 先天免疫是宿主防御病原体入侵机体的第一道防线。 模式识别受体(PRR)是先天性免疫应答的表达传感器，为宿主提供识别和快速应对病原体感染的能力，然后触发一类信号级联，最终确保消除病原体所需的必需效应分子的产生。 在目前的研究中，我们发现EMCV感染7h后，细胞内MXD 88、NFKBIA上调至不同水平。 KEGG通路分析表明激活NF&B可辅助诱导炎症和免疫反应。 4结论首次应用基因芯片分析了EMCV感染N2a细胞的基因表达谱变化，利用获得的芯片数据对EM-CV染的免疫反应、反应途径的总体模式进行分析，探索了EMCV感染分子机制。 EMCV感染N2a细胞后差异表达基因达21143个,其中上调基因为6137个，下调基因为5829个。 涉及的主要途径包括PI3K-Akt信号通路.MAPK信通路、互作用、信通路、TCR/RLR信号通路和细胞凋亡通路等，提示宿主启动不同策略来激活免疫炎症反应以对抗感染。 参考文献(References):1*PALMENBERG AC，KIRBY EM，J ANDAM R，etal.The nucleotideand deducedamino acidse quencesof theencephalomyocarditisviral polyproteincoding region)*.Nucleic AcidsRss，1984，12 (6)2969-2985.2*MURNANE TG，CRAIGHEAD JE，MONDRAG ONH，et al.A.Fatal diseaseof swinedue toenceph-alomyocarditisvirus)J*.Science1960131 (3399)1714畜牧兽医学报50卷498-499)3*ANDJ,JEONGW,JEOUNG HY,et lEncepha-lomyocarditis inKoreaserological surveyin pigsand phylogeicanalysis oftwo historicalisolatesJ*.Vet Microbiol,xx,137(1-2)37-44.)4*BAKKALI KASSIMIL,MADEC F,GUY M,et lSerologicalsurvey ofencephalomyocarditis virusinfection in pigs inFranceJ*.Vet Rec,xx,159 (16)511-514)5*SANGAR DV,ROWLANDS DJ,BROWN F.Encephalomyocarditis virusantibodiesin serafrom apparentlynormal pigsJ*.Vet Rec,1977,100 (12)240-241)6*盖新娜，杨汉春，郭鑫，等.猪脑心肌炎病毒的分离与鉴定J*.畜牧兽医学报，xx,38 (1):59-65.GE XN,YANG HC,GUO X,et al.Isolation andcharacterizationofporcineencephalomyocarditisvirusJ*.Acta Veterinariaet ZootechnicaSinica,xx,38 (1)59-65(inChinese)7*张家龙，盖新娜，马良，等.规模化猪场脑心肌炎病毒感染的血清学调查J*.中国兽医杂志，xx,43 (1)7-9ZHANGJL GEXN MALetal SerologicalsurveyofEMCV infectioninpigson large-scale pigfarmsin Chinaxx-xx)J*Chin sJournalof Vt rinaryM dicinxx43 (1)7-9(inChinese)8*OBERSTE MS,GOTUZZO E,BLAIRP,et lHu manfebrile il nesscaused byencephalomyocarditis virusinfection,PeruJ*.Emerg Infect Dis,xx,15 (4)640-646)9*YUAN WZ,SONG QY,ZHANG XY,et al.Iso lationand molecularanalysis ofporcine encephalo-myocarditis virusstrain BD2from northern ChinaJ*.Inf ctGn tEvolxx21303-30710*YUAN WZ,ZHENG YS,SUN MT,et lDevel opmentof aTaqMan-based real-time reversetran-scriptionpolymerasechainreactionassayforthede-tectionof encephalomyocarditis virusJ*J VirolM thodsxx20760-6511*YUAN WZWANGJC SUNMT etalRapid detection ofencephalomyocarditis virusby one-step reversetranscriptionloop-mediatedisothermalampli-fication methodJ*VirusR sxx18975-782*邹云X,林密,袁万哲,等.稳定表达脑心肌炎病毒先导蛋白N2a细胞系的建立与鉴定*.病毒学报,xx33 (4)524-529ZOU YJ,LIN M,YUAN WZ,et lEstablishment andidentificationofN2ace llineforstablyexpressing theleaderproteinofencephalomyocarditisvirusJ*Chin sJournalofVirologyxx33 (4)524-529(inChin