周艳葛根提取物对酪氨酸酶活性的影响

毕 业 论 文 学生姓名学生姓名周艳学学 号号190301048 院院 系系 淮阴师范学院生物系 专专 业业生物科学 题题 目目葛根提取物对酪氨酸酶活性的影响 Effects of extracts from puerarina on tyrosinase activity 鄢贵龙老师鄢贵龙老师 指导教师指导教师 姓 名 专业技术职称 学位 姓 名 专业技术职称 学位 2007年5月 淮阴师范学院毕业论文 设计 1 摘摘 要要 本文研究了葛根不同提取物对酪氨酸酶活性的影响 结果表明 50mg mL 的葛根素 对酪氨酸酶的激活作用最强 激活率为 87 42 葛根乙醇提物在浓度为 50mg mL 时对酪 氨酸酶的激活作用次之 而葛根水提物在浓度为 50mg mL 时对酪氨酸酶的激活作用相对 较弱 关键词 关键词 葛根提取物 酪氨酸酶 激活作用 淮阴师范学院毕业论文 设计 2 Abstract This article studied on different extracts from puerarina on effect of tyrosine activity The results indicated that the activity ratio to tyrosinase of Puerarin was 87 42 when their density was 50mg mL which was the same as ethanol extracts from puerarina when their density was 50mg mL but higher than water extracts from puerarina Key words extracts from puerarina tyrosinase activation 淮阴师范学院毕业论文 设计 3 目目 录录 1 引言 4 2 仪器 试剂与原料 4 2 1 仪器 4 2 2 试剂 5 2 3 原料 5 3 方法 5 3 1 葛根水提物的制备 5 3 2 葛根乙醇提取物的制备 5 3 3 酪氨酸粗酶的提取 5 3 4 实验方法 6 4 结果 6 4 1 葛根水提物对酪氨酸活性的影响 7 4 2 葛根乙醇提取物对酪氨酸活性的影响 7 4 3 葛根素对酪氨酸活性的影响 7 结论 9 参考文献 10 致谢 11 淮阴师范学院毕业论文 设计 4 1 1引言引言 酪氨酸酶 Tyrosinase TYR 是皮肤黑色素生物合成的主要限速酶 其化学结构为铜 结合糖蛋白 在皮肤黑色素生物合成过程中 酪氨酸羟化生成多巴 多巴氧化生成多巴 醌 二羟基吲哚转化生成吲哚醌 这些反应步骤均需 TYR 参与 无 TYR 时 反应则变得 非常缓慢 TYR 活性与黑色素合成量呈正相关 1 控制其活力即可控制黑色素生成量 色素性皮肤病可分为色素减退和色素增加两大类 分别表现为皮肤颜色变白和变黑 白癜风是最常见的色素减退性皮肤病 发病率为 0 5 2 发病原因复杂 而其发病机 制则是由于人体皮肤和毛囊的黑素细胞内酪氨酸酶的活性减低或消失 导致黑素体生成 的进行性减少或消失而引起的局限性或泛发性脱色素病变 2 黄褐斑是最常见的色素增 加性皮肤病 已知白癜风患者的酪氨酸酶活性降低 3 人们很早就认识到使用上调酪氨酸酶活性 加速黑素生成的药物可提高白癜风的治疗效果 现在看来白癜风皮损区色素重获 除依 赖白斑区残存的表皮黑素细胞黑素生成能力被增强外 毛囊外毛根鞘多巴染色阴性未活 化的黑素细胞被激活也积极参与这一复色过程 大多数能上调酪氨酸酶活性的物质在体 外还呈现出一定的促黑素细胞分化增殖能力 4 同样 抑制酪氨酸酶的活性可以治疗黄 褐斑等色素增加性的皮肤病 随着生活水平的提高 人们追求美的愿望更加强烈 白癜风恰恰是人体外在美的一 种缺憾 因而它是严重影响人们心理健康的疾病 近年来发病率有上升趋势 但目前对 白癜风的治疗仍很棘手 5 而中药对酪氨酸酶活性的影响 可作为治疗某些色素障碍性 皮肤病的一个指标 3 近年来 色素性皮肤病防治的研究热点趋向于中药对酪氨酸酶的 抑制或激活作用 并有望通过这一途径取得突破性的进展 本实验采用酶活性测定法 通过测定不同浓度的葛根水提物 葛根乙醇提物及葛根 素对酪氨酸酶活性的影响作用 从而筛选出对酪氨酸酶活性的激活率或抑制率较佳的葛根 提取物及浓度 为中药治疗某些色素障碍性皮肤病提供一定的参考 2 2 仪器 试剂与原料仪器 试剂与原料 2 12 1 仪器仪器 FZ102 型微型植物试样粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司 100W 增力电动搅拌器 江苏金坛市佳美仪器有限公司 TDL 5 A 离心机 上海安亭仪器厂 淮阴师范学院毕业论文 设计 5 GL 20G 高速离心机 上海安亭仪器厂 SHZ 型循环水真空泵 上海亚荣生化仪器厂 RE 52A 旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂 TE2101 L 电子分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司 DHG 9240A 型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司 BSZ 100 自动部份收集器 上海沪西分析仪器厂有限公司 HDL 组合式紫外检测仪 上海金达生化仪器有限公司 HL 2D 定时数显恒流泵 上海沪西分析仪器厂有限公司 DS 1 高速组织捣碎机 上海标本模型厂制造 722S 可见光分光光度计 上海精密科学仪器有限公司 2 22 2 试剂试剂 L DOPA 乙酸钠 硫酸铵 无水乙醇 冰乙酸试剂均为分析纯 葛根素注射液 2mL 100mg 山东方明药业股份有限公司 2 32 3 原料原料 葛根 安徽 市售马铃薯 3 3 方法方法 3 13 1 葛根水提物的制备葛根水提物的制备 葛根经过粉碎机粉碎后 称取其粉 500g 置于圆底锅内 用纯水 2L 边浸泡边搅拌 1 2h 取上清夜于离心机中 在转速为 4500 转 分时离心 10 分钟 再取其上清夜于高速 离心机在转速为 9600 转 分时离心 10 分钟 沉渣再加 2L 纯水重复以上步骤得上清夜 合并两次上清夜 取上清液用旋转蒸发器蒸去溶剂至浓液 将浓缩液置于干燥箱中干燥 至膏状 待用 3 23 2 葛根乙醇提取物的制备葛根乙醇提取物的制备 称取葛根粉 550g 置于圆底锅内 用 60 乙醇 2 2L 边浸泡边搅拌 1 2h 取上清液于 离心机中 在转速为 4500 转 分时离心 10 分钟 再取其上清夜于高速离心机在转速为 9600 转 分时离心 10 分钟 沉渣再加 2 2L 60 乙醇重复以上步骤得上清夜 合并两次上 清夜 用旋转蒸发器蒸去溶剂至浓液 将浓缩液置于干燥箱中干燥至膏状 待用 3 33 3 酪氨酸酶粗酶的提取酪氨酸酶粗酶的提取 淮阴师范学院毕业论文 设计 6 取 4 保存的马铃薯去皮切碎 按照 1 2 m V 加入 4 预冷的 0 2mol L 乙酸钠缓冲 液 pH5 6 高速匀浆 2min 过滤 滤液于 4 下 8000r min 离心 20min 6 取上清液加入 20 饱和度的硫酸铵 4 1 2h 离心 10000r min20min 沉淀用 0 2mol L 乙酸钠缓冲液 溶解 重复在上清液中分别加入 30 40 55 饱和度的硫酸铵分级沉淀 4 1 2h 离心 10000r min20min 沉淀用 0 2mol L 乙酸钠缓冲液溶解 经凝胶柱收集得到酪氨酸 酶粗酶液 4 保存待用 3 43 4 实验方法实验方法 黑素体内黑色素的生成是以酪氨酸为基质 通过含铜的氧化酪氨酸酶的作用而形成 的 合成途径为从酪氨酸经过多巴 多巴醌 直至吲哚醌为止的各种中间氧化物质聚合 形成了黑色素 7 在酪氨酸酶反应生成黑色素的过程中 酪氨酸酶的催化作用主要发生 在酪氨酸转化为多巴以及多巴转化为多巴醌这两个反应 多巴醌是一有色物质 可以用 分光光度计 475nm 测定 8 酪氨酸酶活力测定方法参照文献 8 其具体操作步骤如下 先将膏状葛根水提取物用 纯水稀释至浓度分别为 50 mg mL 10 mg mL 100 g mL 10 g mL 的溶液备用 然 后按要求添加反应体系所需试剂 本实验的反应体系在离心管中进行 总反应体系分为 四组 每组反应体系为 6mL 其具体成分如表 1 按表 1 准确吸取相应的试剂加入离心管 中后 充分混匀 在室温孵育 5 10min 后 迅速转移至比色皿中 在 475nm 处测其吸光 度 同法分别测试葛根素在浓度分别为 50 mg mL 40 mg mL 30 mg mL 20 mg mL 10 mg mL 的溶液及葛根乙醇提取物在浓度水提取物用纯水稀释至浓度分别为 50 mg mL 10 mg mL 100 g mL 10 g mL 的溶液 表 1 总反应体系组成成分 药品A 组B 组C 组D 组 葛根提取物 V mL22 PH5 6 乙酸钠缓冲液 V mL242 L DOPA 溶液 V mL2222 粗酶液 V mL22 利用各组吸光度 通过计算得出葛根提取物对酪氨酸酶活性的影响效果 其计算公 式如下 9 I D C A B A B 100 A 未加中药样品的加酶混合液所测的吸光度 A A 淮阴师范学院毕业论文 设计 7 B 未加中药样品亦未加酶的混合液所测的吸光度 A B C 加中药样品而未加酶的混合液所测的吸光度 A C D 加中药样品和酶的混合液所测的吸光度 A D 4 4 结果结果 4 14 1 葛根水提物对酪氨酸活性的影响葛根水提物对酪氨酸活性的影响 通过上述酶活性测定法 对葛根水提取物进行测定 得出的结果如表 2 表 2 葛根水提物对酪氨酸活性的激活作用 剂量A 值B 值C 值D 值激活率 50 mg mL0 1170 0441 7961 896 36 99 10 mg mL0 1170 0440 4600 5409 59 100 g mL0 1170 0440 0470 1268 22 10 g mL0 1170 0440 0470 1245 48 由表 2 可知 50 mg mL 10 mg mL 100 g mL 10 g mL 的葛根水提物对酪氨酸 酶激活率分别为 36 99 9 59 8 22 5 48 即 50 mg mL 的葛根水提物对酪氨酸 酶激活率较强为 36 99 10 g mL 的葛根水提物对酪氨酸酶激活率较弱为 5 48 4 24 2 葛根乙醇葛根乙醇提取物提取物对酪氨酸活性的影响对酪氨酸活性的影响 通过上述酶活性测定法 葛根乙醇提取物对酪氨酸酶活性的影响结果如表 3 表 3 葛根乙醇提取物对酪氨酸活性的激活作用 剂量A 值B 值C 值D 值激活率 50 mg mL0 2000 0451 7812 04167 74 10 mg mL0 2000 0450 5450 74428 39 100 g mL0 2000 0450 0490 226 14 19 10 g mL0 2000 0450 0510 224 11 61 由表 3 可知 50 mg mL 10 mg mL 100 g mL 10 g mL 的葛根乙醇提取物对酪 氨酸酶激活率分别为 67 74 28 39 14 19 11 61 可见 50 mg mL 葛根乙醇提 取物对酪氨酸酶的激活作用比 50 mg mL 葛根水提物对酪氨酸酶激活作用强 4 34 3 葛根素对酪氨酸活性的影响葛根素对酪氨酸活性的影响 通过上述酶活性测定法 葛根素对酪氨酸酶活性的影响结果如表 4 淮阴师范学院毕业论文 设计 8 由表 4 可知 50 mg mL 40 mg mL 30 mg mL 20 mg mL 10 mg mL 的葛根素对酪 氨酸酶激活率分别为 87 42 27 81 0 00 32 45 29 14 可见 50 mg mL 葛根 素对酪氨酸酶激活率最强为 87 42 30 mg mL 对酪氨酸酶的激活作用不明显 由表 4 中葛根素对酪氨酸酶的激活率 可以推知 当葛根素溶液浓度在一定的范围内时 葛根 素对酪氨酸酶的激活作用随着葛根素溶液浓度的降低而逐步减弱 当减弱到一定程度时 葛根素对酪氨酸酶的激活作用又会随葛根素浓度的降低而逐渐增强 为什么在低浓度时 激活作用增强 还有待进一步的实验进行说明 其机理目前仍不清楚 表 4 葛根素对酪氨酸活性的激活作用 剂量A 值B 值C 值D 值激活率 50 mg mL0 2040 0530 0520 335 87 42 40 mg mL0 2040 0530 0560 249 27 81 30 mg mL0 2040 0530 1130 264 0 00 20 mg mL0 2040 0530 1040 304 32 45 10 mg mL0 2040 0530 0480 243 29 14 淮阴师范学院毕业论文 设计 9 结论结论 由上述实验可知 葛根水提物和葛根乙醇提取物对酪氨酸酶的激活作用都随其溶液 浓度的降低而减弱 高浓度或低浓度的葛根素溶液对酪氨酸酶都有激活作用 但处于中 间浓度的葛根素溶液对酪氨酸酶的激活作用不明显 其中 50mg mL 的葛根素对酪氨酸酶 的激活作用最强 激活率为 87 42 葛根乙醇提物在浓度为 50mg mL 时对酪氨酸酶的激 活作用次之 而葛根水提物在浓度为 50mg mL 时对酪氨酸酶的激活作用相对较弱 由此推出高浓度的葛根水提物 葛根乙醇提取物及葛根素对酪氨酸酶有较高的激活 作用 可用于临床上因酪氨酸酶活性降低和酪氨酸酶减少所造成的色素缺乏性疾病 儿 茶酚胺类神经递质合成障碍性疾病的治疗 如白殿风等 10 由实验结果可知 葛根的不同提取物对酪氨酸酶的激活作用不同 同种提取物的不 同浓度对酪氨酸酶的激活作用也不相同 因此 在初步筛选时 选择药物的浓度对其激活 酪氨酸酶的活性是十分重要的 本实验为测定不同浓度的葛根提取物对酪氨酸酶活性的激活作用 方法快速简捷 为 初步筛选治疗因酪氨酸酶活性降低和酪氨酸酶减少所造成的色素缺乏性疾病 儿茶酚胺 类神经递质合成障碍性疾病 如白殿风等 的药物提供了依据 淮阴师