牙周致病菌感染对实验性腹主动脉瘤影响的初步探讨.doc

牙周致病菌感染对实验性腹主动脉瘤影响的初步探讨 京口腔医学xx年第24卷第1期Beijing Journalof StomatologyFebr uaryxx，Vo124，No1牙周致病菌感染对实验性腹主动脉瘤影响的初步探讨任爽王冬青孙正【摘要】目的在成功建立牙周致病菌皮下感染和腹主动脉瘤复合动物模型的基础上，初步评价牙周致病菌对腹主动脉瘤形成的作用。 方法选择68周龄雄性C57BL6小鼠，皮下金属螺旋管植入3周后，CaC1涂抹法制备腹主动脉瘤模型，每周在螺旋管内注射牙龈卟啉单胞菌构建牙周致病菌感染模型，第27d抽取01mL螺旋管内液体进行细菌培养。 模型制备8周末处死取血和腹主动脉。 腹主动脉行HE染色和弹力纤维染色进行病理分析。 酶联免疫吸附测定法测量血清中抗牙龈卟啉单胞菌特异性抗体。 结果螺旋管腔内1周内均有活菌检出，血清抗牙龈卟啉单胞菌特异性抗体滴度显著高于非感染组。 CaC1处理8周末，牙龈卟啉单胞菌感染组小鼠的腹主动脉扩张率显著大于未感染组(P001)。 病理结果显示CaC1处理的两组血管结构均有不同程度的破坏，但牙龈卟啉单胞菌感染组小鼠较未感染组腹主动脉弹力纤维破坏更为显著，部分缺失断裂(P0叭)。 结论本实验成功建立牙周致病菌慢性感染和腹主动脉瘤的动物模型。 牙周致病菌感染可能加速实验性腹主动脉瘤的形成和发展。 【关键词】牙龈卟啉单胞菌；腹主动脉瘤；动物模型【中图号】R7802【】A【】1006-673X (xx)O1-0006-04The primary studyof thee fectof peridontopathogenon experimentalabdominal aorticaneurysms RENShuan，WANG Dongqing，SUN ZhengDepartment ofPeriodontology，Capital MedicalUniversity Schoolo fStomatology，Bei fing100050，China【Abstract】Objective Toinvestigate theeffect ofperidont0pathogen Porphyromonas gingivalis(pg)on abdominalaor ticaneurysms(AAA)on amurine mode1Methods Abdominalaor ticaneurysms wasestablished inmice bythe periaorticapplication ofCaC12，and NaC1served ascontro1The micewere inoculatedwith live蹭or vehicleonce aweekResults EJ ghtweeks afterthe periaorticapplication ofeither CaC12or NaC1，a significant increasewas observedin theaor ticdiameter inthe CaC12treatment groupsFurthermore，the changeof theaor ticdiameter wasmore significant inthe bined唯一challenged micethan thatin CaC12-only mice(P005)There wasa significant differencein abdominal aortic dilatationbetween尸g+CaCI2and CaC12一only treatmentgroupsConclusion Theanimal modelwas suessfullyestablished inthis studyPeridont0pathogen infectionmay aeleratethe progressionof experimentalabdominalaorticaneury sms【Key words】Porphyromonas gingivalis；Abdominal aorticaneurysms；Anima lmodel腹主动脉瘤(Abdominal AorticAneurysms，AAA)是腹主动脉壁的扩张膨出，常见于60岁以上的老年人，510的老年男性患有此疾病。 其隐匿性强，一旦破裂，死亡率高达80。 研究表明在美国每年约有45，000人死于腹主动脉瘤，被列为第十大死因。 目前国内还没完整的流行病学资料，预计约有3O万腹主动脉瘤患者。 腹主动脉瘤为多因素疾患，其成因仍未确定。 许多研究显示，感染和炎症在腹主动脉瘤发生、发展过程中起着关键作用J。 牙周炎是由牙龈卟啉单胞菌，伴放线聚生基金项目国家自然科学基金青年项目 (30901678)；北京市科技新星项目 (xx1341)100050北京首都医科大学口腔医学院黏膜科(任爽、孙正)，牙周科(王冬青)通讯作者王冬青，Emailwdqoral163con，电菌，福赛氏类杆菌等革兰氏阴性牙周致病菌引起的慢性炎症性疾病J。 近年来一些流行病学研究显示牙周炎与腹主动脉瘤可能相关，在腹主动脉瘤壁内检出牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis，Pg)等多种牙周病相关致病菌，Pg在AAA患者的病变血管样本中有较高的检测率7I。 提示牙周致病菌在腹主动脉瘤的发生、发展中可能有一定作用，作用机制尚不清楚。 本研究目的在于建立合适的AAA和牙周致病菌感染的复合模型，并初步分析牙周致病菌感染对腹主动脉瘤的影响。 资料和方法1主要试剂及器械弹力纤维EVG染色套装(福州迈新公司)，SZ660B2L体视显微镜(重庆奥特公司)，OPTPro显微图像E京口腔医学xx年第24卷第1期Bejing Journalof StomatologyFebruaryxx，Vo124，No1采集分析系统(重庆奥特公司)。 CaC1粉剂(北京化工厂试剂)，CDC固体和液体培养基(自制)。 2实验动物SPF级C57BL6小鼠，雄性，68周，体重1820g(北京维通利华实验动物技术有限公司)共45只。 3实验方法小鼠皮下螺旋管包埋将直径05r am的镍铬矫正线缠绕成金属螺旋管(长度10mm，直径5mm)，在36水合氯醛(0O1mlg)腹腔注射麻醉下，包埋入全部小鼠的背部皮下_9加J。 分组随机分为4组。 A组l0只，腹主动脉NaC1处理+皮下螺旋管内注射磷酸盐缓冲液(PBS)；B组11只，腹主动脉处理后死亡1只，剩余1O只。 腹主动脉CaC1处理+皮下螺旋管内注射PBS；C组12只，腹主动脉NaC1处理+皮下螺旋管内注射赡；D组12只，腹主动脉CaC1处理+皮下螺旋管内注射冶。 饲养于北京口腔医院研究所实验动物中心，恒温、恒湿，自由饮食。 本研究获首都医科大学动物伦理审查批准。 腹主动脉瘤模型制备改良Longo等_l方法。 36水合氯醛麻醉，常规消毒。 取下腹部正中切口，逐层切开皮肤、肌肉进入腹腔，将肠管推向腹腔外，充分暴露并游离出肾动脉水平以下、髂动脉水平以上的腹主动脉段约5mm。 腹主动脉周围组织以棉球分离保护，B组和D组小鼠用浸过025M CaC1溶液棉粒在腹主动脉表面涂擦5min，浸润20min，干棉球吸尽残余CaC1溶液，生理盐水冲洗干净，关腹缝合。 A组和C组小鼠用NaC1溶液浸润的棉粒同样处理。 腹主动脉模型建立后8周处死，取血和腹主动脉。 细菌培养牙龈卟啉单胞菌ATCC33277(首都医科大学口腔医学研究所)；Pg于CDC固体培养基厌氧培养5d，挑菌至CDC液体培养基厌氧培养2d，液体培养至3代；收集菌液，获取细菌浓度在10菌落数(Colonyforming units，CFU)mL，最终注射浓度为10CFUmL。 细菌注射螺旋管埋人3周后，C组和D组小鼠皮下螺旋管内注射Pg菌液01mL，每周1次，共7次。 A组和B组用PBS溶液同样处理。 实验流程见图1。 螺旋管内液体微生物学分析小鼠背部螺旋管内注入Pg后，第27d均抽取01mL螺旋管内液体，涂于CDC培养基厌氧培养，34d观察菌落形成。 金属螺旋管CaC12溶液生金属螺旋管每周1次，7次处死植入皮下理盐水浸润内注射PgPBS腹主动脉图1实验流程抗Pg特异性抗体检测酶联免疫吸附测定法测量处死时及螺旋管埋入前血清中抗尸g-IgG抗体滴度。 主动脉瘤外径的测量在腹主动脉瘤制模术前及术后8周，显微镜配置摄像头拍照，参照标尺，使用OPTPro数码显微图像分析处理软件测量血管直径。 取20个不同横截面进行测量，最后求得最大直径进行统计学分析。 病理组织学观察动脉组织标本4多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片厚度5m，HE染色；弹力纤维染色。 光镜观察各组血管结构、损伤及炎症细胞浸润程度，弹力纤维的破坏和降解等_1。 对小鼠中膜层弹力纤维的破坏程度进行动脉结构评分。 按血管上、下、左、右4个区域，根据弹力纤维的完整程度分级。 0级弹力纤维完整，呈波浪形；1级弹力纤维结构混乱，尚未断裂；2级弹力纤维局部降解断裂；3级弹力纤维广泛降解断裂。 4统计分析用SPSS120软件，组间比较用单因素方差分析。 结果1皮下螺旋管内活菌检测皮下螺旋管注入活菌后无小鼠死亡，第27天均可见菌落出现，菌量成下降趋势。 2血清抗IgG抗体滴度图2显示重复的皮下感染可造成血清抗PgIgG抗体滴度的显著升高。 PBS对照组没