现代仪器分析--论文

仪器分析仪器分析 结课论 课题课题 高效液相色谱法研究高效液相色谱法研究 系别 生物工程系系别 生物工程系 专业 生物制药技术专业 生物制药技术 班级 制药班级 制药 14321432 班班 学号 学号 201407043240201407043240 姓名 高慧芳姓名 高慧芳 指导老师 王绍良指导老师 王绍良 高效液相色谱法研究高效液相色谱法研究 摘要摘要 高效液相色谱法 也称高压液相色谱法 它是在经典的液相柱色谱的基础 上发展而成的一种高效 快速 高灵敏的色谱分离方法 根据柱内填料的不同 及不同的分离机制 可分为吸附色谱 分配色谱 离子交换色谱及凝胶色谱 由于采用了高效填充剂 并配以高压输液泵 高灵敏检测器 自动记录装置及 自动收集装置 使高效液相色谱法的分离速度及效率均大大提高 更趋于仪器 化 自动化 且使用范围广 制备型的 HPLC 能大量分离制备较纯的样品 随 着计算机技术的不断发展 HPLC 与质谱 核磁共振谱 红外光谱等波谱技术 的联用进展加快 关键字关键字 液相色谱 分类 应用 背景 背景 1903 年俄国植物化学家茨维特首次提出 色谱法 和 色谱图 的概念 茨维特使用色 谱法 chromatography 来描述他的彩色试验 他在论文中写到 植物色素的石油醚溶液从 一根主要装有碳酸钙吸附剂的玻璃管上端加入 沿管滤下 后用纯石油醚淋洗 结果按照 不同色素的吸附顺序在管内观察到它们相应的色带 就象光谱一样 称之为色谱图 一 高效液相色谱法分类一 高效液相色谱法分类 根据分离机理可分为 吸附色谱 键合相色谱 离子交换色谱 大小排阻 凝胶 色谱 液 液分配色谱法 1 吸附色谱分离 吸附色谱法是当组分分子流经固定相 吸附剂 如硅胶或氧化铝 时 不 同组分分子 流动相分子就要对吸附剂表面的活性中心展开竞争 这种竞争能 力的大小 决定了保留值大小 即被活性中心吸附得越牢的分子 保留值越大 2 键合相色谱分离 键合相色谱法是将类似于气相色谱中的固定液的液体 通过化学反应键合 到硅胶表面 从而形成固定相 采用化学键合固定相的色谱法称为键合相色谱 若采用极性键合相 非极性流动相 则称为正相色谱 采用非极性键合相 极 性流动相 则称为反相色谱 这种分离的保留值大小 主要决定于组分分子与 键合固定液分子间作用力的大小 3 离子交换色谱分离 离子交换色谱法是流动相中的被分离离子 与作为固定相的离子交换剂上 的平衡离子进行可逆交换时 它们对交换剂的基体离子亲和力大小的不同而达 到分离的 组分离子对交换剂基体离子亲和力越大 保留时间就越长 4 大小排阻色谱分离 大小排阻色谱法的固定相是一类孔径大小有一定范围的多孔材料 被分离 的分子大小不同 它们扩散渗入多孔材料的容易程度不同 小分子最易扩散进 入细孔中 保留时间最长 大分子完全排斥在孔外 随流动相很快流出 保留 时间最短 5 液 液分配色谱法 分离 液 液分配色谱的固定相和流动相是互不相溶的两种溶剂 分离时 组分溶入 两相 不同的组分因分配系数 K 的不同而被分离 目前广泛使用的化学键合固定 相是将固定液的官能团键合在载体上而制成的 使用化学键合固定相的色谱方法 简称键合相色谱法 可以用分配色谱的原理加以解释 键合相色谱法在 HPLC 中 占有极其重要的地位 是应用最广的色谱法 按照固定相和流动相极性的不同 分 配色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法两类 二 高效液相色谱仪简介二 高效液相色谱仪简介 高效液相色谱仪主要由 输液系统 进样系统 色谱柱系统 检测系统 数据记录处理系统等组成 1 输液泵 高效液相色谱的流动相采用高压泵输送 有不同类型的输液泵 按输液性质可分为恒压泵和恒流泵 目前使用较多的是柱塞式往复泵 2 进样器 进样器是将试样送入色谱柱的装置 一般要求进样装置的密 封性好 死体积小 重复性好 保证中心进样 进样时对色谱系统的压力 流量影响小 3 色谱柱 色谱柱是色谱分离的核心 为了保证色谱柱的柱效高 使用 寿命长 一般使用由专业化工厂生产的商品柱 色谱柱管多由不锈钢制成 内装一 定的固定相 色谱往长一般 10 30cm 内径 2 5mm 化学键合相是广泛使用的固 定相 其中又以十八烷基硅烷键合硅胶的应用最为广泛 4 检测器 样品经色谱柱分离后进入检侧器进行检测 按其适用范围检 测器可分为通用型和专属型两大类 专属型检测器只能检测某些组分的某一性质 紫外检测器 UVD 荧光检测器 ED 属于这一类 它们只对有紫外吸收或荧光发射 的组分有响应 通用型检测器检测的是一般物质均具有的性质 示差折光检测器 RID 蒸发光散射检测器 ELSD 等 液相色谱 质谱联用 LC MS 则是用质谱作为 高效液相色谱的检测器 5 数据记录处理和计算机控制系统 现代 HPLC 的特征是用微机控制仪 器 HPLC 仪器的中心计算机控制系统 即能做数据采集和分析工作 又能程序控制 仪器的各个部件 还能在分析一个试样之后自动改变条件而进行下一个试样的分 析 许多色谱仪的软件系统具有方法认证功能 使分析工作更加规范化 三 高效液相色谱的特点三 高效液相色谱的特点 高压 压力可达 150 300 kg cm2 色谱柱每米降压为 75 kg cm2 以上 高速 流速为 0 1 10 0 mL min 高效 塔板数可达 5000 米 在一根柱中 同时分离成份可达 100 种 高灵敏度 紫外检测器灵敏度可达 0 01ng 同时 消耗样品少 四 高效液相色谱法的应用四 高效液相色谱法的应用 1 在鉴别中的应用 在 HPLC 法中 保留时间与组分的结构和性质有关 是定性的参数 可用于药物的 鉴别 如中国药典收载的药物头孢羟氨苄的鉴别项下规定 在含量测定项下记录的 色谱图中 供试品主峰的保留时间应与对照品主峰的保留时间一致 头抱拉定 头 孢噻酚钠等头孢类药物以及地西泮注射液 曲安奈德注射液等多种药物均采用 HPLC 法进行鉴别 2 在杂质检查中的应用 HPLC 分离效能高 灵敏 在药物的杂质检查中应用广泛 主要用于药物中有关物质 的检查 有关物质 是指药物中存在的合成原料 中间体 副产物 降解产物等物 质 这些物质的结构和性质与药物相似 含量很低 只有采用色谱的方法才能将其 分离并检测 若杂质是已知的 又有杂质的对照品 可用杂质对照品做对照进行检 查 若杂质是未知的 可以采用主成分自身对照法或峰面积归一化法进行检查 3 在含量测定中的应用 用高效液相色谱法侧定含量可以消除药物中的杂质 制剂中的附加剂及共存的药 物对测定的干扰 中药材及其制剂组成复杂 基中不少有效成分的含量测定也越来 越多地采用了高效液相色谱法 五 高效液相色谱法测定五 高效液相色谱法测定 VE 含量含量 1 实验目的实验目的 1 1 了解高效液相色谱仪的基本操作 1 2 了解高效液相色谱仪测定 VE的原理 2 实验原理实验原理 高效液相色谱仪的系统由储液器 泵 进样器 色谱柱 检测器 记录仪 等几部分组成 储液器中的流动相被高压泵打入系统 样品溶液经进样器进入流 动相 被流动相载入色谱柱 固定相 内 由于样品溶液中的各组分在两相中 具有不同的分配系数 在两相中作相对运动时 经过反复多次的吸附 解吸的 分配过程 各组分在移动速度上产生较大的差别 被分离成单个组分依次从柱 内流出 通过检测器时 样品浓度被转换成电信号传送到记录仪 数据以图谱 形式打印出来 VE 维生素 E 又名生育酚或产妊酚 在食油 水果 蔬菜及粮食中均存 在 有抗氧化作用 能增强皮肤毛细血管抵抗力 并维持正常通透性 有改善 血液循环及调整生育功能 抗衰老作用等 VE通过高效液相色谱柱进行分离 PDA 检测器检测 外标法定量 3 实验器材实验器材 3 1 实验样品 VE样品溶液 3 2 实验试剂 浓度为 50 g ml 的 VE标样 3 3 实验仪器 高效液相色谱仪附 PDA 检测器 4 色谱条件色谱条件 色谱柱 C18柱 流动相速度 0 3ml min 进样量 5 l 柱温 30 5 实验结果与讨论实验结果与讨论 5 1 实验结果 本次实验采用的是单点法测定 实验结果见表 1 表 1 液相色谱仪测定苹果的 VE 含量 进样量保留时间峰面积 标样5 l3 59min42217 待测样品5 l3 59min17369 样品中 VE 的浓度 乙烯标样的总量 苹果的峰面积 乙烯标样的峰面积 标样进样量 标样中 的浓度 样品峰面积 样品进样量 标样峰面积 5 l 50 g mL 17369 5 l 42217 20 57 g mL 5 2 实验讨论 本次实验中 测定标样溶液 VE含量时 在指定的保留时间内并未出峰 讨 论分析原因 样品溶液在上周实验后 一直置于离心管中 未避光低温保存 导致样品中 VE氧化 液相测定时没有在相应的时间出峰 本次实验时间较短 且主要目的是了解高效液相色谱仪的基本操作 以及液相色谱仪测定 VE的原理 故结合前组同学对 VE含量的测定数据进行讨论与分析 因时间有限 实验采用了单点法进行测量分析 且无平行重复 这样误差 较大 我们以后实验时 VE标样可以选择 5 个浓度 每个浓度分别测定 3 4 次 取其峰面积的平均值后作标准曲线 这样误差更小 六六 应用前景展望应用前景展望 液相色谱分析是指流动相为液体的色谱技术 是色谱法中最古老的一种 但通过改 进填料的粒度及柱压 在经典的液相柱色谱的基础上引入了气相色谱的塔板理论 在技术上采用了高压输液泵 高效固定相和高灵敏度的检测器 实现了分析速度快 分 离效率高和操作自动化 这种色谱技术被称为高效液相色谱法 它出现不过三十 多年的时间 但这种分离分析技术的发展十分迅猛 目前应用也十分广泛 其 仪器结构和流程也多种多样 典型的高效液相色谱仪结构 高效液相色谱仪一 般都具备贮液器 高压泵 梯度洗提装置 用双泵 进样器 色谱柱 检测器 恒温器 记录仪等主要部件 高效液相色谱更适宜于分离 分析高沸点 热 稳定性差 有生理活性及相对分子量比较大的物质 因而广泛应用于核酸 肽 类 内酯 稠环芳烃 高聚物 药物 人体代谢产物 表面活性剂 抗氧化剂 杀虫剂 除莠剂的分析等物质的分析 对于高效液相色谱的发展前景应 该是非常乐观的 现在的社会的发展节奏很快 各个领域对于分析检验的需求 很多 而分析检验中 HPLC 所占的比重是不言而喻的 已成 化学 医学 工 业 农学 商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术 所以她的发展情景 很乐观 理由有几点 1 随着科技的发展 技术的日臻完善 较之以前色谱分析的方法有了很大程 度的提高 很多科学家在对于一些分析上的难点有了新的突破 这样一个 不断完善的技术在以后的社会发展中一定会扮演着一个重要的角色 2 最近 一些先进的检测仪器成功的用在了高效液相色谱分析法上 使得高效 液相色谱的应用更广泛 并充分利用高效快速 选择