课题3　分解纤维素的微生物的分离 (2).doc

专题2 微生物的培养与应用微生物的实验室培养（一）培养基的基本知识 1培养基的营养成分营养物质定义作用主要来源及所涉及的微生物碳源凡是能提供微生物所需碳元素的物质构成生物细胞、生物体及细胞代谢产物，有些能为异养生物提供能源无机化合物：C02、NaHC03等(自养生物)有机化合物：糖类、脂质、花生粉饼、石油等(异养生物)氮源凡是能提供微生物所需氮元素的物质合成蛋白质、核酸及含氮的代谢产物，也可为异养微生物提供能源无机化合物：N2 固氮菌、NH3、铵盐、硝酸盐有机化合物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等水分生物体内含量最高的组成成分，分为结合水和自由水良好的溶剂、细胞生活及生化反应的介质、参与物质运输及参与生化反应的反应物培养基、大气、代谢产物无机盐为微生物提供大量除C、H、0以外的各种元素细胞组成成分，生命调节物质，自养菌的能源或其他营养来源，酶的激活剂培养基、大气等环境生长因子微生物正常生长繁殖，必不可少的微量有机物可作为酶与核酸等的组成成分维生素、氨基酸、碱基等高考警示钟自养微生物与异养微生物所需的营养物质不同(1)自养微生物所需的碳源、氮源来自含碳、含氮的无机物，而异养微生物需要的碳源、氮源来自含碳、含氮的有机物，因此可根据培养基中营养物质判断微生物的代谢类型。但注意根瘤菌这类固氮菌为异养型,可利用N2 .(2)含氮无机物不但能给自养微生物提供氮源，也能作为能源物质，提供能量，如NH3既作为硝化细菌的氮源也作为能源。2培养基的配制原则 (1)目的明确。要根据微生物的种类、培养目的等选择原料、配制培养基。 (2)营养要协调。各种营养物质要保证适当的浓度和比例。营养物质比例过低，不能满足微生物生长；浓度过高则会抑制微生物的正常生长。营养物质的浓度比(如C/N)还会直接影响某些微生物的代谢产物，如谷氨酸生产，C/N=41时，菌体大量繁殖，谷氨酸产量少；而C/N=31时，菌体繁殖受抑制，但谷氨酸合成量大。 (3)pH要适当。不同微生物生长所需pH不同。如细菌pH保持在6.57.5之间；放线菌保持在7.58.5之间；真菌应保持在5.06.0之间。3培养基的分类及作用：培养基种类很多，作用也不同。根据不同的分类标准，可将培养基分为不同种类。划分标准培养基种类特点用途及实例物理性质液体培养基不加凝固剂工业生产半固体培养基加凝固剂，如：琼脂观察微生物的运动、分类鉴定、保藏菌种固体培养基微生物分离、鉴定、活菌计数、化学成分天然培养基含化学成分不明确的天然物质工业生产合成培养基培养基成分明确(用化学成分已知的化学物质配成)分类、鉴定用途选择培养基培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长培养、分离出特定微生物(如：培养酵母茵或霉菌，可在培养基中加入青霉素；培养金黄色葡萄球菌，可在培养基中加入高浓度食盐)鉴别培养基根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品鉴别不同种类的微生物，如可用伊红一美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，茵落呈黑色，并带有金属光泽)说明：病毒为非细胞结构的生物体，专营活细胞寄生，目前不能利用人工培养基来培养，需接种在动植物组织中才能增殖。常用于培养病毒的是活鸡胚。加入培养基中的凝固剂(如琼脂)，一般不能被微生物利用，只起到凝固作用。选择培养基一般只生长具有特定的微生物，鉴别培养基可以存在其他微生物，而且能鉴别特定的微生物。注意：选择培养基的选择方法(1)在培养基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。这里的加入是在主要营养成分完整的基础上加入。(2)改变培养基中的营养成分。例如缺乏氮源时可以分离出固氮微生物；石油作为惟一碳源时，可以分离出消除石油污染的微生物。培养基中不加入有机物可以选择培养自养微生物；(3)改变微生物的培养条件。例如，将培养基放在高温环境下培养，可以得到耐高温的微生物。（二）灭菌技术1无菌技术的概念在微生物培养中，获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌入侵，其主要技术是无菌操作。无菌技术是指通过一定物理、化学的手段，防止实验室培养物被外来微生物污染。2消毒、灭菌的方法 项目概念常用方法应用范围消毒使用较为温和的物理或化学方法，仅杀死物体表面或内部一部分对人体等有害的微生物(不包括孢子和芽孢)巴氏消毒法：7075水中煮30min或在80水中煮15min一些不耐高温的物体如牛奶煮沸消毒法：在100水浴中煮沸56 min一般物品化学药剂消毒法：用乙醇、氯气、漂白粉、KMnO4等药剂来杀死或抑制细菌生长或繁殖可用来对环境、双手和衣物等消毒紫外线消毒法：30W紫外灯照射30min接种室灭菌使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼烧灭菌法：酒精灯火焰接种工具如接种环、接种针等干热灭菌法：在160170加热12h如玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具高压蒸汽灭菌：压力为100 kPa，温度为12l的条件下，维持1530 min培养基及容器的灭菌注意：无菌操作是微生物培养过程中，防止杂茵污染的关键步骤。消毒只能消灭或抑制营养体的活动，而不能达到彻底灭菌。酒精消毒用体积分数为70%的酒精效果最好，因浓度过高，会使菌体表面蛋白凝固成一层保护膜，乙醇分子不能进入其中；浓度过低，杀菌力减弱。而灭菌除杀死营养体外，还必须杀死芽孢和孢子。灭菌消毒的原理，就是通过一定理化手段，使病原茵蛋白质变性，失去生命活性。紫外线消毒的原理:使蛋白质变性,还能损伤DNA的结构。（三）微生物的纯化培养技术1常用细菌培养基蛋白胨培养基配制流程：计算称量溶化灭菌注意：据配方计算配制一定体积培养基时各成分的用量注意：倒平板时，烧杯口要通过酒精灯火焰灭菌。50平板冷凝后要将平板倒置，可避免水分蒸发，以利微生物生长，也可防止冷却过程中凝结的水滴滴入培养基；其次防止细菌透过皿底、皿盖的缝隙，落在培养基上。倒平板时，不能将培养基溅在皿底与皿盖之间，以防止杂菌滋生，污染培养基（调PH）倒平板注意：牛肉膏较粘稠，应玻棒挑取，在称量纸上称量牛肉膏蛋白胨易吸潮，动作要迅速注意：牛肉膏连同成称量纸一同放入烧杯。溶化琼脂时要控制火力的大小并不断搅拌，防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。加热过程中部分水分蒸发，待琼脂完全溶化后应补加蒸馏水，以保持溶液的浓度注意：由于不同微生物适宜的pH不同，因此在熔化后，必须用NaOH或HCl来调节pH接种划线操作时注意：（1）用接种环取菌种之前、每次划线之前和划线结束都要进行灼烧灭菌，灼烧后要在酒精灯附近冷却后再操作；（2）划线时不要划破培养基，如果采用分段划线法操作从第二次操作应总在上一次划线末端开始，首尾区不能相连；（3）操作必须始终在酒精灯火焰旁进行。涂布操作时注意：（1）配制系列梯度稀释液时，所用的试管和移液管均需灭菌，必须用无菌水配制；（2）涂布器用70%的酒精消毒，多余酒精在烧杯中滴尽，沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰引燃。不要将过热的涂布器放入盛有酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精；（3）配制系列梯度稀释液和转移菌液以及涂布过程等必须都在酒精灯火焰旁进行，移液管头不能接触任何物体。注意：培养基：可用高压蒸汽灭菌法培养皿：用干热灭菌法时温度160170(不能超过180，否则易引起报纸等燃烧)培养制备牛肉膏蛋白胨固体培养基纯化大肠杆菌注意：接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法两种。注意：将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37恒温箱中，培养12h和24h，分别观察和记录菌落特征。菌种保存注意：临时保藏4，缺点：这种方法保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。长期保存：甘油管藏法-201. 第一步灼烧接种环是为了杀死接种环上原有的微生物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死接种环上残留的菌种，使下一次划线的菌种直接来源于上次划线的末端。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。2. 每次划线从上次划线末端开始划线是为了稀释菌种，获得由单个细菌形成的标准菌落。2.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数土样取样原则：人为提供有利于目的菌生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长培养基的成分：尿素作为惟一的氮源(选择培养基、固体培养基)准备选择培养基9个，牛肉膏蛋白胨培养基3个细菌计数菌种的鉴定菌落的特征包括 形状、大小、隆起程度、颜色 等方面。依据菌落特征，可进行初步鉴定，当菌落数目稳定时，选择菌落数在30300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后取平均值。每克样品中的菌落数=（C/V）*M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（ml），M代表稀释倍数方法：用酚红指示剂原理：在细菌分解尿素时，分泌的脲酶将尿素分解为氨，氨使培养基碱性增高，pH升高。制备培养基培养观察样品稀释、取样、涂布平板取样原因：土壤有“微生物的天然培养基”之称，与其他生物环境相比，土壤的微生物数量最大，种类最多。土壤要求：土壤中富含有机质，pH接近中性。取样部位：土壤微生物主要分布在距地表38cm的近中性土壤中，取样一般要铲去表层土。培养：培养不同微生物往往需要不同培养温度和时间。细菌一般在3037培养12d，放线菌一般在2528培养57d，霉菌一般在2528的温度下培养34d。观察：在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。注意：实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。标注在培养皿底部。计数方法：1.活菌计数法：稀释涂布平板法 (结果偏小：因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 2.显微计数法：不宜区分活菌和死菌（血细胞计数板）对照组的设计：1. 检测培养基灭菌是否彻底：未接种微生物的空白培养基。检测选择培养基是否具有筛选作用：用接种同种土壤样液的完全培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）3.分解纤维素的微生物的分离土样取样挑选产生透明圈的菌落进一步鉴定选择产生明显的透明圈的菌落，挑取部分细菌并接种到纤维素分解菌选择培养基上，在300C 370C培养，可获得纯化培养。为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的葡萄糖含量进行定量测定。选择培养将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上梯度稀释选择富含纤维素的环境：如树林中多年落叶形成的腐殖土，纤维素分解菌的含量相对提高。 人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境：将富含纤维素物质如滤纸埋在土壤中，使纤维素分解菌相对聚集，埋纸深约10 cm，30天左右，从腐烂滤纸上筛选纤维素分解菌。（此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定）用1mL无菌吸管从富集培养液中吸取1m注入盛有9mL无菌水的试管，吹吸三次，使其充分混匀，以此类推制成101、102、103、104、105、106倍的稀释液。选择培养目的：增加纤维素分解菌浓度，确保能从样品中分离到所需微生物。选择培养原理：培养基中以纤维素为主要碳源，能产生纤维素酶、水解纤维素的微生物能大量繁殖；不能以纤维素为碳源的微生物生长受抑制；经多次选择培养，可大大提高培养液中纤维素分解菌的比例。选择培养的操作：称取土样20g，在无菌条件下加入装有30mL培养基的摇瓶中。将摇瓶置于摇床上，在30下振荡培养12d，至培养基变混浊。（1）纤维素，一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖