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1植物组织培养的基本原理 讲授内容1 1细胞的全能性1 2植物细胞分化与脱分化1 3植物的形态建成1 4基因表达与位置效应及器官分化信息传递 1 植物细胞全能性 Cellulartotipotency 任何具有完整细胞核的植物细胞 都拥有形成一个完整植珠所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能力 Haberlandt 1902 1 1植物细胞全能性 2 1 1植物组织培养的理论基础 细胞全能性 1 细胞全能性 celltotipotency 植物体的每一个具有完整细胞核的细胞都具有该物种全部遗传的物质 在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力 3 细胞全能性 红罗卜 4 1 2植物细胞的分化与脱分化 1 分化 differentiation 细胞在分裂过程中发生结构和功能上的改变 从而在个体发育中形成各类组织和器官完成整个生活周期 5 高等植物细胞分化示意图 幼年细胞 细胞分裂 多细胞团 形态建成 完整植株 细胞分化 6 1 2植物细胞的分化与脱分化 2 脱分化 dedifferentiation 已分化好的细胞在人工诱导条件下 恢复分生能力 回复到分生组织状态的过程 3 再分化 redifferentiation 脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程 重新形成各类组织和器官的过程 7 离体的植物器官 组织 细胞 脱分化 愈伤组织 再分化 根芽 再生植株 植物组织培养过程 高等植物细胞脱分化和在分化示意图 8 1 3植物的形态建成 9 1 3植物的形态建成 细胞培养再生完整的植株 茎芽分化 器官分化 体细胞胚胎发生 10 外植体的成苗途径 试管苗 外植体 愈伤组织 根 芽 芽 根 根芽 体细胞胚 试管苗 体细胞胚 试管苗 11 主要内容 1 3 1愈伤组织的诱导与器官分化1 3 1 1愈伤组织诱导1 3 1 2器官分化1 3 2植物体细胞胚胎发生1 3 2 1植物体细胞胚胎发生的方式1 3 2 2植物体细胞胚胎发生的极性和生理隔离1 3 3离体器官诱导1 3 4影响植物离体形态发生的因素 12 1 3 4 1植物种类和基因型1 3 4 2培养材料的生理状态1 3 4 3培养基1 3 4 4培养条件 13 1 3 1愈伤组织的诱导与器官分化 一 基本概念脱分化 具有特定结构与功能的植物组织 在一定条件下 细胞改变原来的分化状态 失去原有的结构与功能 转变为具有分生能力的细胞的过程 愈伤组织 植物各种器官的外植体在离体的条件下 细胞经脱分化等一系列过程 转变为分生细胞 进而转变形成一种能够迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团一般低 植物各器官 组织都有被诱发产生愈伤组织的潜在可能性 14 自然条件下的植物愈伤组织 刺桐树 15 1 3 1愈伤组织的诱导与器官分化 一 愈伤组织的诱导诱导愈伤组织的成败关键主要不是实验材料 而是培养条件 其中激素的成分和浓度是最重要的因素 1 常用激素与浓度 16 2 影响愈伤组织诱导的因素 1 激素 多数情况下 单独使用2 4 D可以成功诱导愈伤组织的发生案例1 MS培养基含有不同浓度2 4 D时斑茅幼叶形成愈伤组织的诱导率 不同浓度的2 4 D对愈伤组织的诱导率是不同的 一般情况下 2 4 D的浓度过低 低于10 9mg L 时 愈伤组织生长缓慢 浓度过高 高于10mg L 时 就会抑制愈伤组织的生长 17 案例2 不同培养基及激素浓度对诱导扁桃花药愈伤组织的影响无论在MS还是在H或B5培养基中 不附加激素2 4 D均不能诱导扁桃花药愈伤组织的形成 扁桃花药在H 1 0mg L2 4 D的培养基上诱导率最高为47 在MS 1 0mg L2 4 D培养基上诱导率为67 0 在B5 0 5 1 0mg L2 4 D 出愈率都在84 0 以上 其中以2 4 D为0 5mg L时 出愈率高达100 说明在扁桃花药诱导过程中 最适基本培养基是B5 最佳2 4 D浓度为0 5mg L 18 研究表明 生长素与细胞分裂素对保持愈伤组织的快速生长是必要的 特别是二者搭配使用时更能强烈刺激愈伤组织的形成 在愈伤组织的诱导时 植物材料不同所用的植物生长调节物质不同 使用的浓度也不同 19 2 培养基 不同的培养基成分对植物不同器官的愈伤组织诱导存在着影响 20 二 愈伤组织的形成 愈伤组织从增殖的组织细胞中产生 激素改变细胞的新陈代谢状态 从生长静止期到代谢旺盛 从外植体脱分化形成愈伤组织大致可分为三个时期 起动期 诱导期 分裂期和分化期 三个时期愈伤组织的代谢状况 结构以及细胞的平均大小都有明显的差别 21 1 诱导期 起动期 或起始期 起动期 细胞准备分裂的时期 愈伤组织形成起点 外植体细胞在完整植株中随着细胞的分化过程而逐渐停止分裂 开始执行它们各自不同的功能 外植体细胞一般处于静止状态 称为静止细胞 在外源植物激素的作用下 处于静止状态的植物细胞经过复杂的脱分化过程恢复分裂能力转化为分生细胞 此过程有人称之为 细胞的诱导活化过程 期 并发生同步分裂 22 有人认为损伤是诱导细胞分裂的重要因素 受伤细胞释放出的物质与外源激素共同诱导细胞发生分裂 是诱导植物愈伤组织形成的主要原因 Brown 1972 认为静止细胞是具有分裂能力的 只是被存在的一类抑制物质所阻止 而使其分裂能力不能表现 如果除去抑制物质 就可恢复分裂能力 若加入抵消抑制物质影响的外源物质 激素 细胞就立即进行DNA复制 全部细胞进入S 23 处于起始期外植体 24 特点 在诱导期 代谢活化了 细胞内的合成代谢加强 如合成代谢加强 迅速进行蛋白质和核酸的合成 但是细胞的大小仍然和外植体时一样 没有多大改变 25 诱导期的长短 由一系列内部 植物的种类 生理状况 和外部 光照 外源激素 因素决定 例如 菊芋的诱导期有时还不需要1天 胡萝卜则要好几天 而菊芋块茎贮藏时间的改变 诱导期也发生改变 从11月到次年4月取菊芋块茎进行培养 则诱导期从22小时逐渐延长到40小时 26 改变诱导期长短 主要外因方面是添加一些生长物质Steward等 1964 用2 4 D及其类似的生长调节物质处理处于静止状态的组织 看到RNA的含量很快明显地增加 并且2 4 D积累在分裂细胞的核仁中 Yeoman和Mitchell 1970 指出了核仁是生长物质的作用部位 27 2 分裂期 外植体 explant 中已分化的活细胞在外源激素的作用下 外植体外层细胞出现了分裂 由于外层细胞的迅速分裂使得这些细胞的体积缩小 逐渐回复到分生组织状态 该时期细胞通过脱分化的起动期而进入分裂 并开始形成愈伤组织 28 分裂期特征 生理生化上分裂期的一个明显特征是外层细胞进行分裂 而中间的细胞不分裂 另外还有细胞数目增加 体积变小 细胞核和核仁增到最大 RNA含量达到最高等 此时期的愈伤组织 细胞分裂快 结构疏散 缺少组织的结构 颜色浅而透明 29 分裂期愈伤组织 30 3 形成期 形成期 细胞分裂从分裂期的周缘细胞分裂为主逐渐转向内部的组织细胞 愈伤组织表层细胞分裂减缓或停止 内部深层细胞分裂并形成像维管束或类似于分生组织组成的鸟巢状结构的次生组织 此时期中细胞的伸展和分裂处于平衡 故细胞的平均大小趋于稳定 31 形成期愈伤组织的特点 生长旺盛的愈伤组织一般呈乳黄色或白色 有光泽 也有浅绿色或绿色 而老化的愈伤组织多转变为黄色甚至褐色 32 提醒 根据形态变化列出三个时期 实际上它们的界限并不分严格 特别是分裂期和分化期 一块培养组织的细胞既有分裂的又有分化的 33 愈伤组织的类型 不同植物来源的愈伤组织 在质地 形态和物理性状方面均有明显的差异 有的愈伤组织呈淡黄色或白色 有的愈伤组织呈绿色或红色 一般来说 来源于相同组织的愈伤组织含有的色素大致相同 但经过反复继代培养后会失去色素 34 根尖愈伤组织 无色透明 茎尖愈伤组织 淡绿色 植物愈伤组织类型举例 35 当归茎段愈伤组织 绿色 香茶菜愈伤组织 锁阳愈伤组织 红色 36 影响植物愈伤组织形成的因素 1 同一植株不同器官形成愈伤组织的能力不同 例如 君子兰用MS 2mg L6 BA 2mg LNAA 1mg L2 4 D固体培养基培养 茎尖 茎切块和叶片形成愈伤组织的诱导率分别为85 13 和72 若用MS 5mg L6 BA 0 5mg LNAA 1mg L2 4 D固体培养基培养 三种外植体形成愈伤组织的诱导率分别为82 9 和70 这说明培养基中植物生长物质组成的比例不同 直接影响着愈伤组织的形成 杨宁 1 等人的研究表明 植物扁桃 Naporeil 品种 的茎段 花药在适宜的培养基上能比较容易的诱导出愈伤组织 而叶肉组织则不能或难以诱导形成愈伤组织 37 影响植物愈伤组织形成的因素 2 选择适宜基本培养基不仅影响愈伤组织的诱导 而且影响伤组织的生长 于树宏和李玲 1999 用浅绿色野葛叶片愈伤组织进行继代培养 用MS 1mg LNAA 愈伤组织呈浅绿色 新鲜健壮 在培养基中同时加入3mg L6 BA和1mg LNAA 愈伤组织生长迅速 若培养时间较长 形成的愈伤组织呈白 硬颗粒状 部分会发生褐变死亡 但若将愈伤组织置于含相同浓度6 BA和NAA的B5培养基上生长 愈伤组织可以始终保持新鲜健壮的外观 而且不断生长 杨宁 2 等人用MS培养基作为基本培养继进行当归愈伤组织增殖培养的研究表明 单独使用一种生长素时 愈伤组织增殖很不明显 若只使用一种细胞分裂素时 愈伤组织均不见增殖 并且生长状况也不佳 但将二者合理搭配使用时 愈伤组织不仅增殖较明显 而且生长状况较佳 可见 兼用生长素和6 BA增效作用较明显 38 基本培养基对当归愈伤组织继代的影响 注 表示基本可以生长 表示生长较好 继代较好 表示继代最好 表中数据取材于杨宁等人的 当归愈伤组织的增殖与分化培养 39 不同激素组合对当归愈伤组织增殖的影响 注 表示基本可以生长 表示生长较好 继代较好 表示继代最好 表中数据取材于杨宁等人的 当归愈伤组织的增殖与分化培养 40 1 3 1 2愈伤组织的形态发生 愈伤组织培养物在某些条件下 可以再分化产生不定芽或根的分生组织甚至是胚状体 继之 由这些有结构的组织而发育成苗或完整小植株 愈伤组织通过再分化形成再生植株的方式主要有三种 1 先产生芽 后在茎的基部长根 2 先长根 再长芽 3 愈伤组织的不同部位分别形成根和芽 41 一 愈伤组织形成1 器官的形成一般愈伤组织开始分化时 由大小不等的细胞开始逐渐形成大小均匀的细胞 保持相对稳定状态 在分化时 愈伤组织的表层和内部都可形成分生中心 芽多发生在愈伤组织的表层 属外起源 42 根发生在组织的深处 与整体植株发生类似 是内起源 愈伤组织的外部形态也随分化而改变 一般由疏松转向紧密 43 二 激素对愈伤组织分化的影响 植物生长调节物质在分化过程中的作用是极为明显的 合适的植物生长物质配比在器官分化中起着重要的作用 如仙人掌科的金牛掌茎段培养中 当6 BA的浓度是NAA的50 100倍时 茎段的愈伤组织可以再分化出仔球 而6 BA浓度过高 150倍 或过低 10倍 则无仔球形成 44 愈伤分化 不同浓度的激素对烟草愈伤组织的影响 45 器官分化的植物激素控制理论 大量的实验结果表明 大多数植物组织或器官的再生作用符合器官分化的植物激素控制理论 即 生长素与细胞分裂素的比例小时则产生苗 比例大时则生根 而两种激素的比例适中时 则产生无结构的愈伤组织 46 外植体 愈伤组织 芽 根 再生植株 脱分化 再分化 高生长素 1 2 D 高 生长素 细胞分裂素 低 生长素 细胞分裂素 器官发生途径 47 植物物种和品种基因型影响愈伤组织的分化 程林梅等 2001 的研究表明 利用不同基因型大豆品种的下胚轴作外植体进行组培时 培养基对愈伤组织的影响不明显 细胞分裂素 KT 和NAA的配比浓度对其愈伤组织的分化影响显著 不同基因型大豆植株再生作用差异明显 外植体取材时间和取材部位对再生植株的形成也具有较大的影响 再生能力最强的取材部位时从子叶节到下胚轴6mm区段 当下胚轴长到2 3cm时取材最佳 见表3 6 48 不同基因型 激素浓度对大豆植株再生的影响 资料来源 基因型和激素浓度对大豆植株再生的影响 程林梅等 植物学通报 2001 18 3 367 370 49 木本植物愈伤组织形态发生的人为调控 第一步 利用分化培养基 含有6 BA CPPU KT 使愈伤组织形成不定芽 增加繁殖系数 第二步 当不定芽长大出现叶片后 再将伸长的苗从基部切下转入含生长素类 如IAA NAA 的生根培养基上培养诱导根的生成 50 芦荟愈伤组织形态发生的人为调控 1 先用MS培养附加不同浓度的6BA 促进不定芽的生成 不同浓度6 BA对库拉索芦荟增殖的影响 51 芦荟愈伤组织形态发生的人为调控 2 然后将抽枝的小植株转移到MS附加不同浓度NAA培养基上培养 诱导根的发生与生长 不同浓度NAA对库拉索芦荟生根的影响 52 影响愈伤组织分化的其他因素 1 生长素对维管组织分化过程有显著影响 法国植物学家Camus 1949 最早将小营养芽嫁接在一种菊苣属植物根的愈伤组织 由薄壁细胞构成 表面 营养芽经培养一段时间后分化出维管组织 Wetmore等许多人的研究也证实芽之所以能诱导愈伤组织分化是因为它在生长时合成了某些植物激素 一般说来生长素浓度和木质部发生之间存在着一种反比关系 低浓度的生长素能刺激木质部的发生 生长素对维管组织分化所起的作用在很大程度上取决于糖的存在 在洋丁香愈伤组织培养时 如果灌注到愈伤组织顶面缺口里的琼脂含有0 05mg L的IAA和1 的蔗糖 愈伤组织只能形成很少的木质部分子 若保持生长素浓度不变 而将蔗糖水平增加到2 则有利于木质部的分化 但韧皮部很少 当蔗糖增至2 5 3 5 时 木质部与韧皮部都可以分化形成 而当蔗糖增至4 时 只有韧皮部的分化 53 影响愈伤组织分化的其他因素 2 细胞分裂素能刺激大豆子叶愈伤组织木质部的分化 3 IAA与激动素之间能协同影响烟草愈伤组织木质部的分化形成 生长素与赤霉素对植物愈伤组织的分化形成也存在着协同作用 乙烯也参与木质部的形成 有人研究发现缺乏乙烯的番茄突变体植株木质部内没有导管 但正常植株是具有导管的 4 硝酸银能抑制大豆愈伤组织木质部的分化 加入蛋氨酸可以克服硝酸银的抑制作用 54 四 愈伤组织的培养一 培养基培养基一般包括大量元素 微量元素和一种碳水化合物 最常用的碳水化合物是蔗糖 这样简单的培养基 基本培养基 只有很少几种植物组织能够培养和维持下去 大多数组织需要添加各种各样的附加物 完全培养基 如维生素 氨基酸 糖醇 生长素 细胞分裂素 赤霉素 螯合剂如EDTA 各种营养性的提取物如椰子汁等 55 注意 选用完全已知的合成化合物 不大主张用复杂的天然产物 如酵母提取物 番茄汁 椰子汁等 必须强调 适合于诱发愈伤组织的培养基不一定适合于维持这些愈伤组织 适合于液体培养的培养基也不一定适合于固体培养 56 培养基中的N 大多数都用硝态氮 只有MS培养基和B5培养基中才用硝态和铵态的混合物 K的水平在近代的培养基中有逐渐提高的趋势 实验表