石冬敏专题报告.血小板聚集率测定

血小板聚集率测定标准化操作及临床应用血小板聚集率测定标准化操作及临床应用 石冬敏 南京医科大学附属苏州市立医院本部 苏州 215002 关键词 关键词 血小板聚集率 标准化 诱导剂 血栓 血管壁受损 血小板活化导致血小板粘附聚集和释放反应增强是许多疾病中 血栓形成的重要条件 使用抑制血小板功能的药物已成为预防和治疗血栓性疾病 的常规疗法 1 近年血小板聚集率测定在疾病的诊断治疗和用药监测的作用受到 重视 2 本文从血小板聚集率测定及标准化操作和临床应用三方面进行阐述 并 着重讨论血小板聚集率测定在老年动脉粥样硬化的应用 一 血小板功能检测一 血小板功能检测 最早的检测血小板功能的方法是出血时间 它操作简单快速 但受技术人员 的操作技术 皮肤厚度和温度的影响 且这一方法 在血小板减少的患者测定血 小板功能的缺陷时作用有限 3 已淘汰 现有的血小板功能试验包括血小板粘附试验 血小板聚集试验 PAgT 血 浆血小板球蛋白和血小板因子 4 测定 P 选择素测定 血小板因子 3 有效性测定 血块收缩试验 血栓烷 B2 TXB2 检测 11 脱氢 血栓烷 B2 11 DH TXB2 血小板环核苷酸测定 血小板钙流的测定 5 羟色胺的测定 血小板凝血酶敏感 蛋白测定 血浆纤维连接蛋白测定 血小板膜糖蛋白测定 同种血小板抗体的检 测 4 目前评价血小板功能最常用的方法是 PAgT 二 二 PAgT 和诱导剂和诱导剂 PAgT 包括第一相聚集与第二相聚集 血小板与外源性诱导剂接触后即发生 聚集称第一相聚集 亦称初级聚集 指加入诱导剂 1 分钟的血小板聚集率 PAG 1 它与 GP b a 和 Fg 的相互反应有关 如 GP b a 或 和 Fg 有缺陷 第一相聚集减低 第一相聚集诱导血小板活化 血小板结构发生变化 释放出 ADP 等内源性致聚剂 加剧血小板聚集 称为第二相聚集 又称次级聚集 指加 入诱导剂 3 分钟的血小板聚集率 PAG 3 如血小板释放反应有缺陷 第二相 聚集减低 2 血小板聚集诱导剂有 二磷酸腺苷 ADP 花生四烯酸 AA 肾上腺素 胶原 凝血酶 瑞斯托霉素和前列腺内过氧化物 不同的血小板诱导剂对血小板 的作用有所不同 弱活化剂 ADP 只能引起较微弱的释放反应 依赖于第一相聚 集的跨膜信息传递活化血小板 导致第二相聚集 当 ADP 为 0 3mol L 时 仅有 初发聚集波 第一聚集波 当 ADP 为 0 5 mol 时 可出现双相聚集波 第二聚集 波 ADP 1 0 mol 时 有一个不可逆转的单相波形 即血小板聚集试验 5 分钟 产生的聚集曲线 5 6 凡是促进血小板中的 cAMP 减少的物质如 ADP AA 肾上腺素 凝血酶 5 HT PGG2 PGH2等 都可诱导血小板的聚集 反之 凡是可以使血小板中的 cAMP 增加的物质如 肾上腺素能阻滞剂 肾上腺素能兴奋剂 PGE1 PGD2 PGI2 腺苷 咖啡因 氨茶碱 潘生丁等 都可抑制血小板的聚集 三 三 PAgT 原理和测定原理和测定 血小板聚集检测可分为光学法 PRP 比浊法 阻抗法 血液灌注压法 发 色底物 发光物 聚集剂法 非离心式聚集阈值测定法和切变诱导血小板聚集法 不同的测定方法与 PRP 聚集测定结果相关性不同 7 光学法又分为透射比浊法和散射比浊法 本文重点阐述常用的透射比浊法 1 原理 在磁力搅拌条件下 在 PRP 中加入诱导剂 血小板发生聚集 悬 液浊度随之下降 透光度增加 据透光度变化曲线计算血小板聚集率 8 2 方法 静脉采血 与枸橼酸钠抗凝剂 9 1 在硅化管内混匀 样本低速离 心 1000rpm 5 分钟 取上层富含血小板血浆 PRP 置 37 预温 PRP 中血小 板计数应当标准化 以 250 300 109 L 为宜 可通过加入贫血小板血浆调整 样 本再以 3000rpm 离心 10 分钟 制备贫血小板血浆 PPP 作为空白对照 将小磁 珠放入含有 PRP 的比色皿中 在聚集仪中磁珠以 1100rpm 转动 加入诱导剂 记 录透光度变化曲线 四 四 PAgT 实验标准化操作实验标准化操作 PAgT 影响因素多 结果变异大 调查表明操作者变异 批内变异和天间变 异约范围 15 56 9 10 因此 标准化操作十分必要 主要因素有 1 药物 阿司匹林 潘生丁 肝素 双香豆素等均可抑制血小板聚集 阿 司匹林抑制血小板聚集作用可持续 1 周 故采血前 1 周内不应服用此类药物 11 3 2 采血 静脉采血 避免反复穿刺或气泡混入 组织液可使少量凝血酶形成 引起血小板聚集 应使用 109mmol L 枸橼酸钠厚壁双倍硅化内壁 无死腔 真空 采血管 因为 死腔 可激活血小板 使血小板第 4 因子提前消耗 PAgT 降低 有的抗凝管加入潘生丁等药物 可抑制血小板聚集 12 13 3 抗凝剂 使用单一的枸橼酸钠抗凝剂 血与抗凝剂 9 1 为宜 血小板聚 集作用随血浆中枸橼酸钠浓度的降低而增高 忌用 EDTA 作为抗凝剂 EDTA 由 于螯合 Ca2 作用强 使 ADP 不能引起血小板聚集 14 4 时间 制取 PRP 后 30 分钟内不应进行测定 因此时血小板反应性差 但 整个测定须在 2 小时内完成 15 16 5 诱导剂 ADP 在保存中会自行分解产生 AMP 所以配制成溶液后宜在 20 冰箱中贮存 一般半年内活性不会降低 AA 性质不稳定性 配制贮存运输过 程均要求 20 应用肾上腺素时 应裹以黑纸避光 以减少分解 6 比浊法测定 PAgT 时 比色皿应选择水晶材质 经常清洗 防止蛋白和色 素沉积 造成透光度下降 我们用 COULTER CLENZ TM 清洗液浸泡后蒸馏水冲 洗效果较好 17 7 测定操作 PRP 不可混入红细胞 测定量 200ul 为宜 磁珠直径不可小 否则均可致结果偏低 五 五 PAgT 的临床应用的临床应用 PAgT无需昂贵的仪器和特殊的试剂盒 便于基层实验室开展 操作简单 半 小时内即可得出结果 适用于临床诊断 特别是某些急症患者 临床应用有以下 3方面 1 血小板聚集功能亢进能敏感的发现血栓前状态 当血液处于高凝状态 如伴有血管内受损或血流缓慢则称为血栓前状态 它易导致血栓栓塞形成或加重 栓塞的病理过程的发生和发展 引起一系列的疾病 见于DIC早期 高凝状态和 血栓性疾病 如急性心肌梗塞 心绞痛 糖尿病伴血管病变 脑血管病变 高 脂蛋白血症等 PAgT增高 可以为上述疾病的诊断和治疗提供依据 针对病因进 行治疗 2 血小板聚集率是出血性疾病诊断的常用指标 如 GP b a 或 和 Fg 有缺 陷 PAG 1 减低 如血小板释放反应有缺陷 PAG 3 减低 可初步筛检血小板无 4 力症 巨大血小板综合症 贮存池病及纤维蛋白血症 尿毒症 肝硬变 Wilson 病 维生素 B12缺乏症和感染性心内膜炎等 3 不同诱导剂的血小板最大聚集率 MAR 测定对临床用药的监测作用是 血栓与止血研究课题 肠溶阿司匹林廉价 广泛运用于冠心病的一 二级预防 国际抗血栓联合组的 65 个临床试验发现 应用阿司匹林 ASA 可减少各类栓 塞和血栓事件约 23 18 抗血小板聚集实验者协会分析了超过 10 万例治疗者的 资料 表明 ASA 能使心肌梗死和脑卒中的发生率降低 25 血管移植 动脉栓 塞发生率减少 48 肺栓塞发生率减少 67 深静脉血栓发生率减少 23 19 但仍有部分患者没有抗血栓效应而发生心脑血管血栓事件 这种现象称为阿司匹 林抵抗 aspirin resistance AR 20 氯吡格雷安全性与 ASA 类似 价格略贵 一 般用于 AR 患者 21 两种药物的差别在于药理机制不同 ASA 的抗血小板作用在 于抑制细胞内环氧化酶 ASA 使血小板内花生四烯酸代谢途径的环氧化酶活性基 因第 529 位丝氨酸乙酰化后失去活性 从而抑制血栓烷 A2 TXA2 的生成 ASA 是不可逆的 口服单剂量的 ASA 的抗血小板作用可持续 7 d 接近血小板的平均 生存期 9 10 d 直至骨髓产生新的血小板 研究表明 小剂量 ASA 对血小板 环氧化酶有明显抑制作用 对内皮细胞环氧化酶抑制作用弱 因为内皮细胞有再 生环氧化酶能力 ASA 同时可抑制血管内皮细胞前列环素 PGI2 此点尚有争 论 34 氯吡格雷是一种新型的噻吩并吡啶类衍生物 能选择性的与血小板表面 腺苷酸环化酶偶联的 ADP 受体结合而不可逆地抑制血小板聚集 抑制 ADP 诱导 的 MAR 作用在 3 7 天达到稳态 稳态时对血小板的平均抑制水平维持在 40 60 22 由于 ASA 减少 AA 代谢生成血栓素 阻断了 AA 代谢途径 因此对 AA 诱导 的 MAR 的抑制更显著 氯吡格雷由于能直接抑制血小板表面的 ADP 受体 因此 对 ADP 诱导的 MAR 抑制显著 单以 MAR 很难判断氯吡格雷和阿司匹林哪个抗 血小板作用更强 国外的大型临床试验通过对心血管事件的发生率的长期观察更 科学可信 23 2 种药物最严重的副作用是出血 MAR 测定可能是确定药物个体化 用量的途径 氯吡格雷监测以 ADP 诱导 MAR 为佳 阿司匹林调整理想剂量的指 标应重视 AA 诱导的 MAR 该测定可能是监测阿司匹林抵抗和出血的最佳途径 当阿司匹林将 AA 完全阻断 此时可能出现 AA 诱导 MAR 低于 5 而 ADP 诱 导 MAR 仍在 40 左右 阿司匹林抵抗和出血可能产生 当深入研究 5 六 六 PAgTPAgT在老年动脉粥样硬化的应用在老年动脉粥样硬化的应用 阿司匹林肠溶片因用药不当诱发出血并不鲜见 氯吡格雷是一种新型抑制血 小板药物 多用于阿司匹林抵抗患者 该类患者约占接受阿司匹林治疗者的 10 且多为高龄老干部 24 25 不同诱导剂的血小板最大聚集率 MAR 测定常 用于安全用药监测 亟待自动凝血分析仪应用开发 我们实验分析对比老年动脉 粥样硬化患者应用氯吡格雷和阿司匹林治疗前后的花生四烯酸 AA 和二磷酸腺 苷 ADP 诱导的MAR 报告如下 一 材料与方法 1 临床资料 2005年2月 2007年2月住院的稳定状态的动脉粥样硬化症患 者79例 年龄72 90岁 平均77 8 1 3 9岁 男性60例 女性19例 均为 国 际动脉粥样硬化学会预防动脉粥样硬化性心血管疾病综合指南 所确定的高危人 群 26 具有以下任何一项诊断者 1 稳定型心绞痛或冠脉内支架安置术后 2 彩色超声提示颈动脉斑块或曾有脑梗塞病史或短暂性脑缺血病史者 3 彩色超 声提示下肢动脉粥样斑块形成 排除标准 急性血栓形成 冠脉综合症 脑卒中 急性期 高血压未能很好控制 机械性人工瓣膜和服华法林抗凝者 严重肝肾 功能不全 临床明确的血小板减少症或中性粒细胞减少症及严重感染 入选者随 机分成氯吡格雷组27例 阿司匹林组26例 对照组26例 各组临床资料见表 1 MAR测定实验室正常对照为40例健康体检者 年龄45 7 11 6岁 男 女比例 1 0 表1 不同治疗组临床资料及疾病分布 n 79 氯吡格雷组阿司匹林组对照组 例数 272626 年龄 岁 78 7 4 277 5 4 177 3 3 3 男 女 21 619 720 6 冠心病 374 颈动脉斑块 1189 下肢动脉斑块 110 动脉粥样硬化 脑梗塞 短暂性 脑缺血 12 1013 蛋白尿 534 高血压 141314 2 型糖尿病 766 合并症 慢性心衰 232 6 动脉粥样硬化疾病组成 X2 2 831 P 0 586 合并症疾病组成 X2 0 770 P 0 993 2 方法 临床实验为随机 平行研究 均针对原发病治疗 避免使用抗凝 剂和其它抗血小板药物 氯吡格雷组早餐后口服波利维 赛诺非 德拉堡公司产 品 批号 1949 每片75mg 75mg d 1 7天 阿司匹林组早餐后口服阿司匹林 肠溶片 济南永宁制药公司产品 批号 061102 每片25mg 100mg d 1 7天 总疗程2周 包括1周安慰剂清洗期和1周药物治疗期 对照组未使用任何抗血小 板药物 均在治疗前后用109mmol L枸橼酸钠小容量 2 7ml 厚壁双倍硅化内壁 真空采血管 无死腔 晨空腹采血 立即用透射比浊法测定AA和ADP诱导的 MAR 27 3 仪器与试剂 抗凝管由 BD 公司生产 采用普利生 LBY NJ2 血液凝聚仪 诱导剂 AA 终浓度为 200mg L 由上海度生公司提供 ADP 终浓度为 11 2umol L 由普利生公司提供 4 统计分析 数据以 x s 表示 计数资料采用 X2检验 治疗前后的计量资 料采用配对 t 检验 组间比较采用 F 检验 二 结 果 1 表1 资料表明 3组患者男 女分别为3 5 2 7和3 3 组间性别 年龄 病种X2检验差异无显著性 P 0 05 具有可比性 2 本实验室正常对照值AA诱导MAR为43 1 15 7 ADP诱导MAR为 64 1 17 0 与对照组治疗前后MAR值 见表2 比较 0 05 无显著 差异 表明本实验质量控制较好 结果可靠 3 氯吡格雷组1例因皮疹退出 其余均完成实验 各组治疗前后MAR测定值 配对t检验见表2 氯吡格雷组和阿司匹林组治疗后MAR均降低 均有非常显著差 异 P0 05 表明2组药物治疗后2种不同诱导剂 的MAR下降均具有统计学意义 表 动脉粥样硬化患者氯吡格雷和阿司匹林治疗前后不同诱导剂 MAR 配对 t 检验 x s 诱导剂 氯吡格雷组n 26 阿司匹林组n 26 对照组n 26 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 7 AA 47 0 14 3 36 1 18 6 49 6 17 6 13 6 12 6 48 2 20 6 46 9 17 3 ADP 63 5 12 8 36 7 16 8 64 7 16 6 50 3 16 7 62 9 10 8 65 4 15 1 注 P 0 01 4 2 组药物治疗前后 2 种诱导剂 MAR 差值见表 3 方差齐性检验各组方差齐 性 F 1 540 05 方差分析见表 4 4 组间有非常显著差异 P 0 01 各组两两分析比较见表 5 各组间均有非常显著差异 P 0 01 分析 结果表明 2 组药物治疗后用不同诱导剂测出的 MAR 均有差别 表 3 氯吡格雷组和阿司匹林组治疗前后 2 种诱导剂 MAR 差值 x s 诱导剂 氯吡格雷组 n 26 阿司匹林组 n 26 治疗前后差值 d AA 13 1 12 5 38 1 15 5 ADP 28 4 13 5 18 7 14 1 表 4 方差分析表 变异来源 平方和 自由度 均方 F P 组间效应 9457 6 3 3152 5 218 0 0 01 组内效应 1445 6 100 14 5 总变异 10903 2 103 表 5 各组两两比较 比 较 处理数 T 平均数差值 标准误 Q 值 0 01 Ti100 P 阿司匹林 AA 氯吡格雷 AA 4 38 1 13 1 25 0 0 746 4 5 3 357 0 01 阿司匹林 AA 阿司匹林 ADP 3 38 1 18 7 19 4 0 746 4 2 3 133 0 01 阿司匹林 AA 氯吡格雷 ADP 2 38 1 28 4 9 7 0 746 3 7 2 760 0 01 氯吡格雷 ADP 氯吡格雷 AA 3 28 4 13 1 15 3 0 746 4 2 3 133 0 01 氯吡格雷 ADP 阿司匹林 ADP 2 28 4 18 7 9 7 0 746 3 7 2 760 0 01 阿司匹林 ADP 氯吡格雷 AA 2 18 7 13 1 5 6 0 746 3 7 2 760 0 01 8 5 2 组药物治疗前后 2 种诱导剂 MAR 结果见图 1 如图所示 氯吡格雷治疗 后 AA 诱导的 MAR 下降率约为服药前的 23 2 ADP 诱导的下降率约为 42 2 而阿 司匹林则相反 治疗后 AA 诱导的 MAR 下降率约为服药前的 52 4 ADP 诱导的下 降率约为 22 3 表明药物的药理作用不同 从临床用药安全性监测角度考虑 氯吡格雷抑制二磷酸环化酶作用较强 治疗期间更应重视 ADP 诱导的 MAR 阿司匹 林抑制花生四烯酸代谢较强 治疗期间更应重视 AA 诱导的 MAR 指标的下降 图1 2组药物治疗前后2种诱导剂MAR比较 0 10 20 30 40 50 60 70 AA诱导ADP诱导AA诱导ADP诱导 氯吡格雷组阿司匹林组 MAR 治疗前 治疗后 三 讨 论 1 阿司匹林肠溶片是抗血栓治疗常用药 因用药不当诱发出血并不鲜见 氯吡格雷是一种新型的噻吩并吡啶类衍生物 能选择性的与血小板表面腺苷酸环 化酶偶联的ADP受体结合而不可逆地抑制血小板聚集 抑制ADP诱导的血小板聚集 率作用在3 7天达到稳态 稳态时对血小板的平均抑制水平维持在 40 60 28 29 30 近年多用于阿司匹林抵抗患者 31 该类患者约占接受阿司匹 林治疗者的10 且多为高龄老干部 体外测定MAR常用于安全用药监测 本实验 入选患者的平均年龄78岁 全部为稳定状态的动脉粥样硬化患者 2 血小板聚集包括第一相聚集与第二相聚集 加入诱导剂1分钟的血小板 聚集率称第一相聚集 又称初级聚集 PAG 1 与GP b a和Fg的相互反应 有关 如GP b a或 和Fg有缺陷 第一相聚集减低 在第一相聚集的诱导下血 小板活化 结构变化 释放ADP等内源性致聚剂 加剧血小板聚集 称第二相聚 集 又称次级聚集 指加入诱导剂3分钟的血小板聚集率 PAG 3 如血小板 9 释放反应有缺陷 第二相聚集减低 MAR是加入诱导剂4 5分钟之间的血小板最 大聚集率 32 凡是促进血小板中的cAMP减少的物质都可诱导血小板的聚集如 ADP 肾上腺素 胶原 凝血酶 瑞斯托霉素和前列腺内过氧化物 不同诱导剂 对血小板的作用不同 33 ADP诱导MAR是测定血小板活性的常用方法 AA性质不稳 定性 配制贮存运输均要求 20 有些实验室弃用在于该分寸未掌握 MAR测定 值临床可信度在于采血 分离和比色等环节的质量控制 近年来应用自动凝血仪 提高了血栓与止血的检测质量 我们期待MAR测定的全自动分析 本实验对照组 治疗前后MAR均值与总体均值 检验无显著差异 表明实验质量控制较好 结果可 靠 3 以使用不同诱导剂的MAR 很难判断氯吡格雷和阿司匹林哪个抗血小板 作用更强 国外的大型临床试验通过对心血管事件的发生率的长期观察更科学可 信 本文结果显示 应用氯吡格雷和阿司匹林治疗后MAR的下降均具有统计学意 义 两种药物的差别在于药理机制不同 氯吡格雷直接抑制血小板表面的ADP受 体 因此对ADP诱导MAR抑制显著 阿司匹林的抗血小板作用在于不可逆的抑制细 胞内环氧化酶 减少AA代谢生成血栓素 由于阻断了AA代谢途径 因此对AA诱导 MAR抑制更显著 4 本观察表明 MAR测定可能是确定药物个体化用量的途径 使用不同的诱 导剂可产生不同的结果 从临床用药安全性监测角度考虑 氯吡格雷监测以ADP 诱导MAR为佳 阿司匹林调整理想剂量的指标应重视AA诱导MAR 该测定可能是监 测阿司匹林抵抗和出血的最佳途径 当阿司匹林将AA完全阻断 可能出现AA诱导 MAR低于5 而ADP诱导MAR仍在40 左右 阿司匹林抵抗和出血可能产生 当深入 研究 参参 考考 文文 献献 1 齐若梅 血小板与血栓形成 世界医学杂志 2002 11 54 56 2 王新德 刘芳 血小板聚集功能检测在阿司匹林预防缺血性脑血管病中的应用 中国现代 神经疾病杂志 2004 4 2 77 79 3 Rodgers RP Levin J A critical reappraisal of the bleeding time Semin Thromb Hemost 1990 16 1 1 20 4 王学锋 王鸿利 主编 血栓与止血的检测及应用 第 1 版 上海 世界图书出版公司 2002 127 163 10 5 彭黎明 王兰兰 主编 检验医学自动化及临床应用 第 1 版 北京 人民卫生出版社 2003 310 325 6 许文荣 谷俊侠 主编 临床血液学检验 第 1 版 南京 东南大学出版社 2001 125 300 7 Nylander S Johansson K Van Giezen JJ et al Evaluation of platelet function a method comparison Platelets 2006 17 49 55 8 谭齐贤 主编 临床血液学和血液检验 第 3 版 北京 人民卫生出版社 2003 262 298 9 Cornelissen J Kirtland S Lim E et al Biological efficacy of low against medium dose aspirin regimen after coronary artery analysis of platelet function Thrombosis and Haemostasis 2006 95 476 482 10 Nicholson NS Panzer Knodle SG Haas NF et al Assessment of platelet function assays The American Heart Journal 1998 135 170 178 11 Storey RF Heptinstall S Laboratory 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