pcr中GC含量过高的问题

PCR 中 GC 含量过高的问题 DNA molecule 4849 Length 1212 base pairs Molecular Weight 370809 00 Daltons single stranded Molecular Weight 741128 00 Daltons double stranded G C content 70 96 A T content 29 04 Nucleotide Number Mol A 173 14 27 C 438 36 14 G 422 34 82 T 179 14 77 解决 1 由于基因中 GC 含量过高 就不应该用普通的 buffer 了 而应该用特殊的 GC buffer 对于 TM 值可以做一下梯度 PCR GC buffer 可以在一些公司都 能买到 买 TAKALA 的 GC buffer for PCR 还有 设计一段合适的引物确定 你模板中确实有你的目的片段也是很有必要的 2 只是为了 PCR 获得基因的话 你可以尝试用 68 度 94 度这种两步 PCR 法 3 gc 含量是有些高 建议你换一种保真性比较高的酶 建议还是不要用 japan 公司的 现在有好多高保真的酶 sigma 的 jumpstart taq et al 都可以扩增 高 gc 的模板 另外 DMSO 也是一种办法 但是 这种办法需要你凭经验确 定加入的量 一般来说 5 已经足够了 最好不要超过 10 因为过高的 DMSO 反而会一直 taq 酶对 pcr 的特异性扩增 4 用 Takara 的 long Taq with GC buffer 效果很好 我做的是链霉菌 所以 GC 含量也在 70 多 我 P 的效果很好 5 可以试着加点 DMSO NaOH 甘油等东西试试 以解除其二级结构的影响 当然现在也有专门这种 PCR Buffer 卖 6 如果实在不行 就用 advantage 2 high GC taq polymeras clontech 效果好 就是贵了点 可以用双温法试试 比如 35 个循环 总变性之后 前五个循环双温即没有延伸 后三十个循环三温 具体温度根据引物 Tm 值定 我试过效果不错 如果基因的 5 端含有丰富的 GC 碱基 设计的 PCR 引物 Tm 值很高 用普通 PCR 很难理想地扩增出此基因 用热启动 hot start 和降落 PCR 能取得了 较好效果 在 PCR 开始时加入 Qiagen 公司的 Hotstar Taq DNA 聚合酶 并延 长起始变性时间如 95 变性 15 min 能使模板 DNA 完全变性 以便提供最大 数量的引物配对位点 可避免引物二聚体和非特异性配对 PCR 反应过程中 首先在高于引物 Tm 值的 72 左右扩增几个循环 然后把退火温度逐渐降到两 引物的 Tm 值附近 在随后的循环中 对退火温度进行梯度实验 这样能保证 第一引物 模板杂交事件发生在最互补的反应物之间 即那些产生目的扩增产物 的反应物之间 尽管退火温度最终会降到非特异杂交的 Tm 值 但此时目的扩 增产物已开始几何级扩增 在剩下的循环中处于超过任何非特异 PCR 产物的地 位 因此 降落 PCR 既能增加反应特异性 又能提高 PCR 产物的产量 为你设置循环条件为 95 变性 15 min 94 45s 72 30s 退火温度 每循环降低 2 0 72 45s 5 个循环 94 45s 设置退火温度梯度从 55 到 65 30s 72 45s 30 个循环 72 延伸 10min 几点建议 先优化反应条件 GC 丰富的序列 退火温度其实也不用刻意加高 主要是变性温度 预变性 96 度 5 分钟然后再加酶 热启动 一般循环的变性温度用 95 度比 94 好 还不行还可以再加高 还有 DMSO 和甘油 各加到 5 就足够了 光加 DMSO 有的时候会使酶的半衰 期下降 引物 GC 含量分别高达 70 以上时 用普通 PCR 很难理想地扩增出此基因 因 为 G C 之间形成三对氢键 解链所需能量较高 故模板较难打开 在常规变 性温度下 DNA 模板变性不完全 同时由于单链的 G C 丰富区易于自身互补 配对形成稳定的发夹环二级结构 而使 PCR 引物难于结合到模板上 DNA 聚合 酶也难于延伸或停止延伸 结果常出现严重的非特异性条带 甚至扩增不出靶 基因 在扩增高含量 GC 的基因时 可对 PCR 条件进行几个方面的优化 1 热启动 hot start PCR 使用热启动 PCR 一方面通过扩增前的加热 使 双链模板充分解链 另一方面 通过高温启动反应 促进引物的特异性复性与 延伸 增加有效引物的长度 提高了反应的特异性与灵敏性 并减少了引物二 聚体或多聚体的形成 从而能提高 GC 富集区的扩增效率 我们采用 Qiagen 公 司提供的 Hotstar Taq DNA 聚合酶 此酶含有一种热不稳定性保护抗体 Taqstart antibody 该抗体在低温时与 Taq 酶结合 抑制其活性 当反应体系 达到一定的温度后 这种热不稳定性保护抗体就从 Taq 酶上脱落下来 Taq 酶 得以恢复活性 我们在 PCR 开始时就加入 Hotstar Taq DNA 聚合酶 并延长起 始变性时间如 95 变性 15 min 能使模板 DNA 完全变性 以便提供最大数量 的引物配对位点 避免了引物二聚体和非特异性配对 2 降落 TD PCR PCR 开始时的退火温度高于估计的 Tm 值 随着循环的 进行 退火温度逐渐降到 Tm 值并最终低于这个水平 退火温度选择应根据引 物的长度及 G C 的含量 在 Tm 值允许的范围内 较高的退火温度可大大减少 引物和模板的非特异性结合 提高 PCR 反应的特异性 首先在高于引物 Tm 值 的温度扩增几个循环 然后把退火温度逐渐降到两引物的 Tm 值附近 在随后 的循环中 对退火温度进行梯度实验 这样能保证第一引物 模板杂交事件发生 在最互补的反应物之间 即那些产生目的扩增产物的反应物之间 尽管退火温 度最终会降到非特异杂交的 Tm 值 但此时目的扩增产物已开始几何级扩增 在剩下的循环中处于超过任何非特异 PCR 产物的地位 因此 TD PCR 既能增 加反应特异性 又能提高 PCR 产物的产量 3 Mg2 浓度 dNTP 浓度 引物浓度 模板等也影响 PCR 的产量及产物特异 性 它们的浓度过高反应特异性降低 过低则 PCR 产物产量减少 即高特异的 反应条件可能与高产量的反应条件并不一致 2 TransStart FastPfu Fly dna Polymerase 特点 1 新型热启动 2 快速扩 增 3 高保真性 4 强扩增能力 5 高灵敏度 6 高产量 适用 范围 1 扩增高 GC 含量 具有二级结构等复杂模板 2 高保真扩增 基因克 隆 基因定点突变等 3 长片段扩增 3 当然 也可以尝试对模板进行预变性 如加入适当的 NaOH 处理模板 8 如果 GC buffer LA 扩不出还可以考虑用 TaKaRa 的 PrimerStAR 虽然有广告嫌 疑 虽然不喜欢 R 货 但是确实好使 我有几个片段在 3k 作用 GC 含量 70 用 gc buffer I 和 II 都试过不好使 后来用 primerstar 68 两步法扩出 来了 9 NEB 现在有两种 DNA 聚合酶适合扩增高 GC 含量的片段 1 One Taq DNA 聚合酶 非常适用于扩增高 GC 含量或者复杂模板的 DNA 其 中含有 GC Buffe