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文档简介

实验三考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 一 目的 掌握考马斯亮蓝G 250染色法测定蛋白质的原理和操作 了解分光光度法测定蛋白质的几种方法 进一步熟悉分光光度计的使用 二 原理分光光度法测定蛋白质的几种方法 1 双缩脲法 在碱性条件下 蛋白质能与铜离子结合形成紫红色络合物 540nm 1 10g L 与蛋白质的相对分子量及氨基酸组成无关 快速 不受硫酸铵干扰 灵敏度低 需要样品量大 2 Folin 酚试剂法 Lowry法 在碱性条件下 蛋白质首先与铜离子形成紫红色络合物 该络合物以及Tyr Trp残基还原Folin试剂 产生深蓝色 750nm 0 03 3g L或500nm 0 05 0 5g L 灵敏度高 需要样品量少 但干扰因素多 操作试剂配制麻烦 不同蛋白质之间差异大 3 考马斯亮蓝染色法 在酸性环境下 棕红色的考马斯亮蓝与蛋白质通过疏水力相结合 蓝色化合物 595nm 颜色深浅与蛋白质含量成正比 0 01 1g L 灵敏度高 需要样品量少 不同蛋白质之间差异大 4 紫外分光光度法 280nm 不同蛋白质之间差异大 三 仪器 721分光光度计 使用前预热20min 移液管 四 实验试剂 标准蛋白质溶液 用牛血清白蛋白配成含蛋白质0 1mg mL的标准蛋白溶液 染色液 考马斯亮蓝G 250溶液 称取0 1mg考马斯亮蓝G 250 溶于50mL90 乙醇中 加入85 的磷酸100mL 蒸馏水定容到1000mL 贮放在棕色瓶中 此溶液在常温下可放置1个月 待测蛋白质溶液 五 实验操作 1 标准曲线 蛋白质含量为0 0 1mg mL 的绘制 利用1 2 3 4 5 6号试管数据绘制 1号试管调零 2 样品提取液中蛋白质浓度的测定7 8好试管数据取平均值 调0 注意事项 如果测定要求很严格 可以在试剂加入后的5 20min内测定光吸收 因为这段时间内颜色最稳定 测定中 蛋白 染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上 但此复合物的吸附量可以忽略 测
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