第10章 甾体激素类药物的分析-2-2013

药物分析学（第十五章）,甾体激素类药物的分析（2）,本节教师： 韩海 （博士/副教授 )暨南大学药学院Tel:-mail: QQ: 56011856,2013.11.11, 第二节 鉴别实验,1. 物理常数2.化学鉴别:母核和各种官能团的反应呈色反应、官能团反应：沉淀反应、卤素反应3.制备衍生物测定熔点4. 紫外分光光度法5. 红外分光光度法6.色谱法TLC、HPLC,物理常数, 呈色反应, （一）与强酸的呈色反应（甾体母核）与硫酸、磷酸、高氯酸、盐酸等呈色.硫酸呈色反应应用最广1)反应颜色最丰富2)灵敏度较高可能机制为浓硫酸与甾体的酮基质子化反应，形成正碳离子，然后与HSO4-作用。,特点：操作简便，反应灵敏，通过形成的颜色或荧光的不同而互相区别，但操作条件不易掌握。某些甾体激素药物与硫酸乙醇或硫酸甲醇作用而呈色。如甲睾酮.雌性激素药物常以硫酸乙醇的呈色反应来鉴别.例: Chp中雌二醇鉴别取本品约2ml，加硫酸2ml溶解，有黄绿色荧光，加三氯化铁试液2滴呈草绿色，再加水稀释，则变为红色。, （二）官能团的呈色反应,利用官能团的呈色反应可区别不同的药物 1.C17-醇酮基的呈色反应C17-醇酮基有还原性，能与氧化剂四氮唑盐反应显色。例:(Chp中醋酸泼尼松鉴别)醋酸泼尼松在碱性条件下与氯化三苯四氮唑试液反应生成红色。,讨论：1).本反应亦可用于薄层色谱法鉴别甾体激素类药物的显色反应。 （如醋酸泼尼松片及眼膏、醋酸氟氢可的松软膏等）2).该呈色反应不仅能用做皮质激素类药物的鉴别和检查(“其他甾体”的检查)，也是该类药物含量测定的依据。3).C17-醇酮基还可以和斐林试液、多伦试液发生反应。, 2.酮基的呈色反应C3-酮基、C20-酮基能与2，4-二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯肼等羰基试剂反应形成黄色的腙。例如:氢化可的松，其乙醇溶液加新制的硫酸苯肼试液，加热即显黄色。 3.甲酮基以及活泼亚甲基能与亚硝铁氰化钠、间二硝基酚、芳香醛类反应呈色。,其中亚硝基铁氰化钠反应是黄体酮的灵敏、专属的鉴别方法。在一定的条件下，黄体酮显蓝紫色，其他常用甾体激素均不显蓝紫色，而呈现淡橙色或不显色。 4.酚羟基的呈色反应C3为酚羟基的雌激素，能与重氮磺酸反 应生成红色偶氮染料。JP(14)收载的苯甲酸雌二醇利用该法进行鉴别。,含炔基的甾体激素（如炔雌醇、炔诺酮等）,白色炔银盐沉淀,硝酸银,5. 乙炔基沉淀反应, 6. 有机卤素反应,有机氟,F,有机破坏,有机氯,Cl,茜素氟蓝 硝酸亚铈,硝酸硝酸银,AgCl,呈色,卤素在母核上：氧瓶燃烧法破坏如地塞米松磷酸钠,卤素在侧链上：加热水解法破坏如丙酸倍氯他索,7.酯的反应,香,C17或C21位羟基酯，应先水解；再根据羧酸的性质鉴别。例：醋酸酯类药物,戊酸、己酸酯类药物，有特臭。,制备衍生物测定其熔点,原理1.甾醇、甾酮类药物可与一些试剂反应生成酯、肟、缩氨脲. 测定其熔点进行鉴别。2.利用醇制碱液水解甾体酯类生成相应的母体，测定其熔点进行鉴别。特点繁琐费时，但专属性强.目前仍为一些国家药典采用。,炔雌醇,m.p.201,紫外分光光度法,原理：具有C=C-C=O共轭系统， -3-酮 240nm和C=C-C=C共轭系统，苯环（B带：280nm，K带：220nm ）1.可用规定波长处的吸收度鉴别如:曲安西龙2. 吸收度的比值法。如: 丙酸倍氯米松,-3-酮 240nm, 红外分光光度法,必要性1.许多重要的甾体激素药物紫外光谱非常相似，紫外光谱鉴别缺乏专属性。2.甾体激素药物化学结构上仅有微小的差异，也难以用化学鉴别法来区分。,红外分光光度法的优势,1.对样品无破坏, 样品用量较少 2.特征性极强、 信息量丰富: 每种化合物都有红外吸收，从红外光谱可以得到大量信息。官能团区的吸收反映了化合物中官能团的特征，而指纹区的吸收对于指认分子提供了可靠的依据。,红外分光光度法的应用,各国药典几乎均采用红外分光光度法鉴别甾体激素原料药物，中国药典中36种甾体激素原料药物，其中33种采用该方法鉴别！,鉴别方法:按规定录制红外光谱图，要求供试品光谱图与对照品光谱图一致。,甾体激素药物的红外光谱特征,红外光谱主要反映了化合物中官能团的特征.甾体药物中有那些红外活性基团?1.基本骨架：大量的CH3、CH2、CH基团,. C-H 15001300 cm-1,CH3,2962 cm-1，反对称伸缩振动,2872 cm-1 ，对称伸缩振动,CH2,2926 cm-1，反对称伸缩振动,2853 cm-1 ，对称伸缩振动,29702850cm-1,1375 cm-1处的吸收分叉，等高,1460，1375 cm-1同时有吸收,伸缩振动,弯曲振动,2.此类药物大部分含有C=C双键CH伸缩振动频率大于3000cm-1（峰尖、弱）大约3040 3010cm-1 CC伸缩振动频率在16201585cm-1, （峰尖、中等）CH（面外弯曲振动频率）与双键上氢的数目，即取代情况有关。,3.此类药物大部分含有羰基羰基峰极强, 鉴别价值大. C=O 六员环 17201705cm-1 C=O 五员环 17491742cm-1 C=O C20 17101706cm-1 C=O 4 3 酮16841620cm-14.此类药物还可能含有羟基、醚键等特征结构。,甾体激素药物某些基团的红外特征频率,见书292-293页表10-3炔雌醇的红外吸收光谱,结构特征：苯环、酚羟基、C17 OH C17 乙炔基,1505cm-1,3505cm -1,3300cm-1,1590cm-1,3610cm-1,酚羟基,醇羟基,1616cm-1,苯环的骨架振动,亚甲基、角甲基吸收带,CH,苯环指纹区,黄体酮,薄层色谱法,特点：简便、快速、分离效能高。主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别ChP很多甾体激素制剂均用该法鉴别。应用范围：甾体激素制剂的鉴别、纯度检查以及含量测定前的分离和制剂稳定性的研究。,方法：对照品法 1.供试品点样通常需做前处理（如有机溶剂提取），消除注射液、片剂及软膏剂等辅料的干扰。 2.要求供试品溶液所显主斑点的颜色和位置与对照品溶液的主斑点相同。显色方法：多用荧光显色法或荧光淬灭法荧光显色,高效液相色谱法,主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别方法：对照品法一般在含量测定的同时进行鉴别. 要求在含量测定项下记录的色谱图中，供试品峰的tR与对照品峰的tR一致。,第三节、特殊杂质检查,必要性：甾体激素药物多由结构改造来，可能带来原料、中间体、异构体、降解产物以及试剂、溶剂等。药典规定检查的重要项目有： （一）其他甾体（二）硒（三）有机溶剂残留量 （四）游离磷酸盐 此外，有些甾体药物还规定其他检查项目。,Li/NH3 C2H5OH（可能残留）,弱酸,雌二醇3甲醚（可能残留）,苯丙酸诺龙的合成路线,I（可能残留）,II（可能残留）,强酸（可能残留）,苯丙酰氯（可能残留）,HCl,III（可能残留）,苯丙酸诺龙的合成路线,II,（一）其他甾体,定义：药物中存在的具有甾体结构且与标示药物结构不同的其他化合物都称为 “其他甾体”。 具有互相不同的药理作用！ 有必要检查来源：原料、中间体、异构体、降解产物特点：（1）可能存在多个甾体杂质 （2）结构类似，多数为未知物质,分析方法必须具有一定分离能力,其他甾体检查法, （一）TLC检查法（高低浓度对比法）使用最为普遍的甾体特殊杂质检查法采用供试品的稀释溶液做对照，以对照溶液斑点颜色为参比来控制杂质限量。中国药典2005版36种甾体激素原料药物，其中33种采用该方法检查特殊杂质！例：教材294页醋酸泼尼松、炔雌醇的杂质检查,33种甾体激素药物TLC色谱条件的特点总结： 1.薄层板：大多采用硅胶G板，少数采用硅胶GF254或硅胶HF254。 2.溶剂: 氯仿-甲醇/甲醇/氯仿/丙酮 3.展开剂系统：首选不同比例的二氯甲烷-乙醚-甲醇-水混合溶剂。（其他：苯/无水乙醇/二氯甲烷-甲醇-水/氯仿-甲醇等） 4.显色剂：首选碱性四氮唑蓝试液。 （其他：硫酸-乙醇/浓硫酸/10%磷钼酸-乙醇） 5.检测法：紫外灯(254nm/365nm)/日光检视。,TLC判定方法,规定杂质斑点数目 规定杂质斑点颜色 供试品溶液如显杂质斑点，不得多于XX个，其颜色与对照液的主斑点比较，不得更深。 高低浓度对比法,雌二醇杂质检查TLC图,特点：,（1）简便易行，不需特殊的仪器； （2）不需对照品；（3）要求杂质斑点与主成分斑点的颜色相近且显色灵敏度也接近。（4）不能控制全部杂质的限量；也不能控制杂质的总量,自身对照,（二）HPLC法,方法：1.自身对照法（加/不加校正因子）采用供试品的稀释溶液做对照，以对照溶液主峰面积为参比来控制杂质限量。例：教材295页黄体酮杂质检查为不加校正因子的自身对照法。 2.主成分归一化法（HPLC-UV法检测灵敏度较低时）,黄体酮中有关物质检查,供试品溶液的杂质峰数不得超过1个，其面积不得大于对照液的主峰面积的3/4,甾体激素药物HPLC色谱条件的特点总结：1.色谱柱：十八烷基硅烷键和硅胶。 2.流动相：各种不同比例的甲醇-水混合溶剂。 3.检测器：紫外（214nm/254nm/281nm，230nm/288nm） 4.判定方法:规定杂质峰数目 规定杂质峰面积,HPLC法进行药物特殊杂质检查的特点,（1）需特殊的仪器； （2）不需对照品； （3）可以控制杂质的总量； （4）杂质与主成分测定的灵敏度可以不同。（用校正因子消除）,（二）硒的检查,来源 合成中用二氧化硒(SeO2)脱氢,原理,方法,剧毒,含硒物质,限量0.01%,（三）有机残留溶剂的检查,必要性：甾体激素药物在生产工艺中使用大量有机溶剂。（特别是甲醇和丙酮）测定法：GC法示例 ：地塞米松磷酸钠有机残留溶剂的检查方法。（教材396页）,判定标准,1.甲醇 不得超过0.3%（g/g） 2.丙酮 不得超过0.5%（g/g） 内标法 + 校正因子定量!限量确定的原则药品注册的国际技术要求（ICH）规定 甲醇第二类毒性溶剂限量100） UV法含量测定与羰基试剂（异烟肼）反应 异烟肼比色法2. C17 醇酮基（皮质激素）还原性 与氧化剂四氮唑盐反应显色 四氮唑比色法,3.甾体母核（特别是雌激素母核）可以以强酸的呈色 Kober反应比色法甾类药物含量测定方法有：1.反应比色法（异烟肼比色法、四氮唑比色法、Kober反应比色法）2.紫外分光光度法3.高效液相色谱法4.柱前衍生化气相色谱法、GC-MS法5.放射免疫分析法（FIA），ELISA技术,一、高效液相色谱法,必要性：甾体激素类药物常含有结构相似的其他甾体杂质，对利用结构特征设计的比色法有干扰。优点：用样量少，灵敏度高，分离效果好，专属性强 ChP中：89种甾体激素原料和制剂，有43种采用RP-HPLC法（一般用内标法）含量测定，占该类药物含量测定方法的48%，居首位。,实例：教材397页特点总结：1.分离模式: 反相分配色谱2.固定相: 十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)3.流动相: 甲醇和水的混合液 (个别采用甲醇水乙醚、乙腈-水-乙丙醇、甲醇-四氢呋喃-水等溶剂系统，有时在流动相中加入醋酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液调节pH值）4.紫外直接检测: (240nm或280nm附近)43酮基和苯环,二、紫外分光光度法,1.皮质激素、雄性激素、孕激素4-3-酮基（C=C-C=O）共轭系统max=240nm 2. 雌激素（具有苯环）苯环（C=C-C=C）共轭系统，max=280nm（此吸收较弱）,UV,醋酸地塞米松,优点：准确、简便，被广泛用于原料和制剂的分析。原料、注射液稀释成一定浓度后即可直接测定。但在片剂分析时需要预处理排除干扰。 （赋形剂在240nm附近有吸收，需先用一定溶剂提取、滤过。）Chp中收载的89种甾体激素原料和制剂25种用该法测定含量，占本类药物分析的28%，仅次于HPLC，居第二位。但现在正在被HPLC取代中！,实例,1.原料药:教材398页: 炔雌醚2.片剂:教材398页: 醋酸泼尼松龙片赋形剂在240nm附近有吸收，需先用乙醇提取、滤过。计算, 三、反应比色法,方法介绍:比色法: 直接比色法光度活性药物 反应比色法非光度活性药物,弱、非光度活性药物,强光度活性药物,化学反应,优点：1. 适用于非光度活性药物2. 使待测组光谱位移，避免干扰，增加选择性3. 增加测定灵敏度,甾体激素的反应比色法,异烟肼比色法、四氮唑比色法、Kober反应比色法（一）、异烟肼比色法原理：,HCl,（缩合）, 四氮唑比色法,基本原理：肾上腺皮质激素类C17-醇酮基具有还原性，在强碱性溶液中能将四氮唑盐定量地还原为有色甲 多为红色或蓝色。 formazan在一定波长处进行比色测定。,反应机理,C17-醇酮基失去2个电子氧化为20-酮基-21醛基，在碱催化下，分子内部重排。而四氮唑盐得到2个电子，开环形成甲而显色。,四氮唑盐的种类,1.氯化三苯四氮唑2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chlorid，TTC）其还原产物为不溶于水的深红色三苯甲(max:480490nm) 红四氮唑（red tetrazoline，RT）。,2.蓝四氮唑（blue tetrazoline，BT），即3，3-二甲氧苯基-双-4，4-（3，5-二苯基）氯化四氮唑3，3-dianisole-bis4，4-（3，5-diphenyl）tetrazolium chloride其还原产物为暗蓝色的双甲 ，max525nm。,测定方法对照品法,ChP TTC（RT） BP TTC（RT）USP BT,实例：醋酸地塞米松磷酸钠含量测定,ChP方法供试液：精密量取本品5 mL （约醋酸地塞米松25 mg），置100mL量瓶中，加无水乙醇振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀。滤过，取续滤液为供试品溶液。 对照液：精密称取醋酸地塞米松磷酸钠标准品25 mg，置100mL量瓶中，加无水乙醇振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀。,测定法：精密量取上述溶液各1 mL，分别置干燥具塞试管中，各精密加无水乙醇9 mL与氯化三苯四氮唑试液1 mL，摇匀，再各精密加氢氧化四甲基铵试液1 mL，摇匀，在25暗处放置4050分钟，照分光光度法，在485 nm的波长处分别测定吸收度，计算。操作应避光。,水分影响反应速度,制造强碱性环境,反应过程、反应产物怕光,讨论各种因素的影响,1.基团的影响：,C11= O C11OHC21OH C21-酯C16无论何种取代基,2. 溶剂、水分的影响含水量5%含水10%A10%含水30%几无反应, 无水乙醇,醛 A 无醛无水乙醇,3.碱的种类和加入顺序的影响：反应应在强碱性（pH13.75）条件下进行以氢氧化四甲基铵的结果最佳. 皮质激素和氢氧化四甲基铵长时间（24h）接触后，部分分解.加入顺序：,4. O2与光线的影响,反应过程反应产物,怕光,避光、快速,O2影响颜色强度和稳定性,隔绝空气、 快速、充N2,5. 温度与时间t但t 甲 分解%一般以室温或30恒温条件下显色，易得重现性较好的结果。,特点：,缺点 影响因素太多，操作不易掌握。优点 专属性很好。意义：测定结果能指示药品的稳定性（氧化及降解产物无此反应） 广泛应用于皮质激素的稳定性研究。,异烟肼比色法,反应式：,暗45,实例：,ChP：,倍他米松倍他米松磷酸钠,倍他米松,讨论,1.溶剂选择：无水乙醇和无水甲醇好，其他溶剂受异烟肼盐酸盐溶解度影响不宜采用。甲醇稳定性较好，呈色强度较高。但对植物油溶解度小。一般采用无水乙醇作为整个反应的介质。（倍他米松、倍他米松磷酸钠等）,2.酸的种类和浓度以及异烟肼的浓度：酸与异烟肼试剂的摩尔比为2:1时可获得最大吸收度。酸度异烟肼盐酸度 A试液配制:取异烟肼75mg，加盐酸0.1m1加甲醇使溶解成100ml。,盐酸：0.0074mol/L（硫酸：0.0037mol/L 醋酸：4.4mol/L）异烟肼：0.00365mol/L,3.水分、O2与光线的影响(1)水分增高吸收度降低，缩合物水解；可逆反应:含水量腙水解A%故仪器及试剂应尽量避免水分(2)温度升高，反应加速。(3)在不挥发溶剂、不吸收水分时，光与氧不影响反应。（具塞容器）,4.反应的专属性：反应速度C3 = O C17= O 、 C20= O C11= O 不反应,室温不到1h即可定量地与酸性异烟肼反应,KOBER反应比色法,定义：指雌激素与硫酸-乙醇共热呈色，用水或稀硫酸稀释后重新加热发生颜色改变，并在515nm附近有最大吸收。原理：（两步反应）,max=465,max=515,实线第一步反应虚线第二步反应,可能原理（了解）通过去羟基、重排及甲基由C13移到C17；然后被硫酸氧化形成具有较长共轭双键发色团的产物 又进一步生成具有吸收光谱红移发色团的产物。,max=515nm,实例,ChP 复方炔诺酮滴丸中炔雌醇片的含量测定方法教材402页,缺点：1.第二步反应难以彻底进行，会出现双色。 2. 辅料，赋形剂干扰测定,改进,铁酚试剂法,五、体内甾体激素类药物分析（了解）,四、非水滴定米非司酮,刺激剂麻醉剂-阻断剂利尿剂遮蔽剂合成类固醇及2激动剂肽类激素,内源性,1、甾体激素类药物的结构中能和四氮唑盐发生显色反应的基团 A. 酚羟基 B. 活泼次甲基 C. 甲酮基 D. C17 -醇酮基 E. 酮基,2、用异烟肼比色法测定甾体激素药物含量时，其溶液的环境是 A酸性 B中性 C强碱性 D弱碱性 E以上都不对,3、可用于氢化可的松鉴别的试剂有 A氨制硝酸银 B异烟肼 C红四氮唑 D浓硫酸 E重氮苯磺酸,4、可用于甾体激体类药物的测定方 法有 A高效液相色谱法 B四氮唑盐法 C紫外分