个体化医学与分子诊断

,个体化医学与分子诊断,周宏灏,中南大学，长沙,分子 诊断质量保证会议, 2013,10,22 长沙,人类个体的遗传变异, 31.6亿个碱基对, 2-2.5万个基因,300万变异,疾病相关,药物反应差异相关,不同个体DNA序列 99.9% 相同0.1%,基于基因组的个体化医学罕见疾病风险查出孟德尔疾病致病基因,早期疾病预测孕前/胚胎植入前筛查,药物基因组学风险分层,药物效应和剂量不良反应预测常见疾病风险风险预测风险分层查出早期的行为异常风险显现1,发病易感遗传缺陷,早期查出,针对性预防疾病发展,预测对药物的可能反应,监测药物反应和发病反复,健康状态,无症状疾病状态,慢病治疗,有症状疾病状态,个体化医学和个体化药物治疗个体化医学当今医疗保健重点,病人分层 / 治疗未来医疗保健重点个体化药物治疗,疾病基因组学,药物基因组学,药物临床研究和应用的相悖,临床试验对象群体用药对象个体,基因,人数,药物代谢酶遗传变异引起疗效和毒性个体差异,使用相同剂量后体内药物总量,酶活性过高,酶活性适中,酶活性过低,无效,毒性,血内药物浓度,?,均有哮喘急性发作,受体遗传变异引起疗效和安全性个体差异哮喘发作终止,均吸入2肾上腺素受体激动药沙丁胺醇(Albuterol)沙美特罗 (Salmeterol)死亡2肾上腺素受体基因变异 (Arg/Arg16),正常细胞,无融合蛋白,CML细胞,融合基因,BCR-ABL,正常细胞,Her2+,乳腺癌细胞融合蛋白伊马替尼,特异性靶点伊马替尼抑制BCR-ABL络氨酸激酶，用于bcr-abl融合基因阳性的慢性粒细胞性白血病,过表达靶点赫赛汀是人源化Her-2单克隆抗体，对 Her-2有高亲合力， 用于 Her-2受体过表达的乳腺癌赫赛汀Her2+受体,个体化治疗应用之1：作用于特异性或过表达靶点,维生素K,（减少）,氯比格雷,华法林肠吸收,代谢CYP2C9CYP4F2CYP2C19,肝,氯比格雷GPlla/lll P2Y12受体 受体,华法林肝细胞,NADH NAD+,主动循环药,VKORCI维生素K（氧化）,功能性凝血因子,次功能性凝血因子,血小板细胞,药物效应动力学 血小板膜糖蛋白(GP)IIa/III和膜蛋白P2Y12受体基因多态性：氯比格雷 VitK环氧化还原酶基因多态性：华法林,药物代谢动力学 氯比格雷 (前药)：CYP2C19基因多态性 华法林：CYP2C9 基因多态性,个体化治疗应用之2：预估药物效应和剂量,CYP2D6,弱代谢者乳腺癌复发显著增加, 生存率降低,CYP2D6抑制剂合用, 高活性代谢产物去甲他莫昔芬血浆水平减少65-75%,欧洲药品管理局药物警戒工作组,（PhVWP）认定:, CYP2D6弱代谢者对他莫昔芬的治疗应答可能降低避免合用CYP2D6抑制剂,他莫昔芬,活性:100X,4-OH-N-,去,甲他莫昔芬(Endoxifen),个体化治疗应用之2：预估药物效应和剂量-他莫昔芬: 选择性雌激素受体调节剂; 女性乳腺癌,Cellular TGN,Cellular TGN,个体化治疗应用之2：预估药物效应和,0,10,20,30,0,0,10,20,30,0,42,1086,*2, *3A, *3C,*1,TPMT Activity,0,10,20,30,0,6-10% 65% Conventional dose,基于TPMT基因型的剂量5000500,基因,检测,常规剂量毒性风险高5000剂量毒性风险低500,个体化治疗应用之2：预估药物效应和剂量根据TPMT基因型确定6-MP剂量,剂 量 （ % ）,A,B,C,D,依据:PK 值AUC,CL,常规剂量,基因型特异性剂量,m/m,w/m,w/w,w/nw,常规相,同剂量,个体化剂量,个体化治疗应用之2：预估药物效应和剂量 - 单因素,250-200-150-100-,50-0-,A,B,C,D,理想药物浓度,理想药物浓度,理想药物浓度,理想药物浓度,药 物 清 除 率 （ ）,药理学差异,Molecular Psychiatry (2012), 1 - 15,个体化治疗应用之2：预估药物效应和剂量,药物清除率（）,药理学差异,Molecular Psychiatry (2012), 1 - 15,个体化治疗应用之2：预估药物效应和剂量,N Engl J Med. 2009,19; 360(8): 753764.,68.6,13.3,7.2,6.7,2.61.6,UnknownVKORC1CYP2C9AgeHigh + BWOthers,各因素解释华 Factors药剂量差异原因百分比,法林用 for warfarin dosing,VKORC1 A/GCYP2C9 *1/*3,VKORC1 A/ACYP2C9 *3/*3,Clinicalalgorithm,No geneticvariation,Personalized medication application 2:prediction of drug effect and dosage-Multiple factor, Pharmacogenetic dosing algorithm (international multiple center containing 9 contries and4043 subjectsWarfarin dose（mg/d）= 5.6044 0.2614(age) + 0.0087(height in cm) + 0.0128 (weight in kg) 0.8677(VKORC1-1639 A/G) 1.6974(VKORC1-1639 A/A) 0.4854(VKORC1 genotype unknown) 0.5211(CYP2C9*1/*2) 0.9357(CYP2C9*1/*3) 1.0616(CYP2C9*2/*2) 1.9206 (CYP2C9*2/*3) 2.3312(CYP2C9*3/*3) 0.2188 (CYP2C9 genotype unknows) 0.1092(Asian race) 0.2760(Blacks) 0.1032(Mixed race) + 1.1816(Enzyme induces) 0.5503(Amidarone) 2/7The International Warfarin Pharmacogenetics Consortium, N Engl J Med 2009;360:753-64.,Percentage of prediction,X,Y G,a,ge IW A,nd,PC e Ta,r o ka,s,n ha,s,hi W,en H,ua,n,g Yo,u M,i,ao O,hn,o K,im,C,ho,Z h Sc,u o W,nc ad,e el,iu,s,100500,underidealover,Algorithms,The dosing calculatedvia Xiang Ya dosingalgorithm is more closeto the actual requiredfor the individualpatient from SouthCentral area of China,Personalized medication application 2:prediction of drug effect and dosage-Multiple factorXiang-Ya PGx dosing algorithmWarfarin stable dose (mg/d) = 2.140 0.370(VKORC1-1639GA) 0.332(CYP2C9*3) + 0.324(BSA) 0.004(age in decades) 0.231(number of increasing INR drugs) + 0.105(smoking habit) 0.135(preoperative stroke history) 0.108(hypertension)2,Personalized medication application 2:prediction of drug effect and dosagePGx research of TCM Tianqi hypoglycemic capsule,184 ADMET-related loci,SNPrs1142345,GeneTPMT,AlleleA/G,MAF0.229,p0.001,FDR P0.038,rs2306168 SLCO2B1 T/C,0.305,0.003,0.114,rs2231142rs717620,ABCG2ABCC2,A/CC/T,0.2600.230,0.0210.023,0.7980.874,rs1799931 NAT2 A/Grs4244285 CYP2C19 A/Grs4124874 UGT1A1 G/T,0.1530.3440.337,0.0240.0270.044,0.91211,Li X, Evidence-Based Complementary andAlternative Medicine, 2013/10.1155/2013/327629,Each group (%),Percentage of each group in rs1142345 heterozygote(AG) and wild-type (AA) patients.Li X, Evidence-Based Complementary andAlternative Medicine, 2013/10.1155/2013/327629,Heterozygote,Witt type,Personalized medication application 2:prediction of drug effect and dosage0.7-,0.6-0.5-,HelthyMaintenlance,Deterioration0.4-0.3-0.20.1-0-,结肠癌病人 (n= 59)45级嗜中性白血球低下,Innocenti et al, J Clin Oncology 22:1-7, 2004,50%减少剂量或换药,*28/*28,10%12.5%减少剂量或换药Wt/*280%常规剂量,Wt/Wt,个体化治疗应用之3：预测和预防药物毒性伊立替康毒性发生率与UGT1A*28基因型,卡马西平(Cabamazepine) 癫痫性发作,神经痛等神经性疾病 HLA-B*1502,疱、紫癜、坏死；死亡率3040%,多形糜烂性红斑(Stevens-JohnsonSyndrome， SJS) 多形性红斑，发热、小,别嘌呤醇(Allopurinol) 原发性和继发性痛风病人，控制高尿酸血症, HLA-B*5801,个体化治疗应用之3：预测和预防药物毒性卡马西平和别嘌呤醇引起的 SJS, Allopurinol, Primary and secondary goutpatients, hyperuricemia HLA-B*5801Allele positive: 85/90 (94.4%), Rs9263726 AAllele positive: 82/90 (91.1%),Personalized medication application 3:prediction and prevention of drug toxicityHLA-B*5801 and surrogate SNP rs9263726 areassociated with allopurin-SCAR in mainland Chinese,Patients,Allele positive,/total (%),OR (95% CI),399.5(74.62139.4),HLA-B*5801Allopurinol-SCARAllopurinol-Tolerated,85/90 (94.4%)2/49 (4.1%),Rs9263726 A,240.9(49.11181.7),Allopurinol-SCARAllopurinol-Tolerated,82/90 (91.1%)2/49 (4.1%),ADR 发生率,Individual risk,1000010001001010.1,1E-10,1E-09,1E-08,1E-07,0.000001 0.00001,0.0001,0.001,0.01,0.1,1,5000 不良反应,突变基因频率,引起ADRs的药物 59% 经多态性DME代谢,个体化治疗应用之3：预测和预防药物毒性药物不良反应发生率与突变基因频率相关100000,在下列情况下，药厂必需提供药物基因组学资料 (这些必需提交的药物基因组学资料会影响FDA对这些药物的决策);,1. 对药物标签上的剂量、安全性或有效性有重要参考价值的资料2. 在有遗传学标志物的亚组人群中进行的药物临床试验资料3. 已知遗传变异与药物反应相关的资料，如细胞色素CYP2D6基,因。,对于大多数其他的药物基因组学资料，例如这些资料并非作为临,床试验或销售申请的一部分，则无强制要求，但FDA鼓励其自愿,提交。,（2005）,FDA批准药品说明书中的遗传变异,生物标记,药物或代表药,123456789,CC趋化因子受体5(CCR-5)EGFR 表达等Her2/neu 过表达费城染色体阳性反应等C蛋白缺损 (遗传性或获得性）TPMT 变异UGT1A1 变异HLA-B*1502 等位基因尿素循环障碍(UCD),马拉维若(抗逆转录病毒药)西妥昔单抗、帕尼单抗、吉非替尼核赛汀(Herceptin,曲妥珠单抗达沙替尼华法林硫唑嘌呤伊立替康卡马西平丙戊酸,10 CYP2C9 突变等11 Vit K 环氧化还原酶 (VKORC1) 变异12 家族性高脂蛋白血症 LDL受体缺损或突变13 G6PD 缺损14 HLA-B*5701 等位基因,华法林华法林阿托伐他汀拉布立酶阿巴卡韦,生物标记,药物或代表药,1516171819202122232425262728,C-KIT 表达PML/RAR(a)表达(维甲酸受体反应/无反应)UGT1A1 变异等CYP2C19 突变CYP2C9 突变CYP2D6 变异CYP2D6 和其他变异第五对染色体长臂间隙基因缺损DPD 缺损EGFR 表达EGFR 表达等G6PD 缺损等NAT 变异费城染色体阳性反应者,伊马替尼甲磺酸维甲酸尼罗替尼伏立康唑塞来昔布托莫西汀盐酸氟西汀来那度胺卡培他滨埃罗替尼吉非替尼 （头颈癌）伯氨喹异烟肼，马利兰马利兰,FDA批准药品说明书中的遗传变异, ,确认期,PoC,开发期,发现期,研究,商业,开发,I 期,0 期,II 期,III 期,申报,上市IV 期,选择靶点,先导化合物产生与优化,试剂盒批文、上市应用与上市后评估量体裁衣给药和监测临床验证体外检测分析,生物标记发现和确证靶点确证研究分析,伴随诊断的可行性和吸引力选择病人技术验证分析,药物和生物标记检测方法和试剂盒同步开发,Xalkori (crizotinib, 克里唑蒂尼), 酪氨酸激酶抑制剂，治疗间变性淋巴瘤激酶(ALK)阳性的局部晚期或,转移性非小细胞肺癌(NSCLC)。, 同时还批准了雅培的Vysis ALK Break-Apart FISH检测试剂盒，使用该,试剂盒检测ALK阳性的NSCLC患者可采用Xalkori进行治疗。,Zelboraf (vemurafenib, 威罗菲尼), BRAF抑制剂，用于晚期转移性或不能手术切除的黑色素瘤的治疗。, FDA还批准了首个用于检测cobas 4800 BRAFV600突变的诊断试剂。,同步开发实例,2011年FDA批准的用于有特定基因突变的亚组人群抗癌药,2004-4：个体化治疗咨询中心,2006-2：个体化治疗遗传分析中心,2010-9：中南大学湘雅医学检验所,1990年代中南大提出个体化用 药物治疗,中期：学的个体化,中南大学个体化药物治疗的应用和推广,2013-8：国家卫生计生委个体化医学检测培训基地,中南大学药物基因组学(个体化医学)转化医学链,临床服务基因检测方法建立、临床个体化治疗咨询、培训、基因检测服务湘雅医学检验所,产品生产药物相关基因变异检测试剂盒后期，即产品申报和生产长沙、武汉、上海生物产业公司已提供企业11个成熟前期产品供企业申报，其中已有获批者,基础研究遗传变异发现、确证、实验研究、 (小样本大样本)临床研究临床药理研究所30年基础研究：300篇SCI论文57个基因81个位点,前期产品药物相关基因变异检测方法的建立和标准化及试剂盒前期湖南个体化医学产品培育基地已经积淀212个成熟检测项目，待研发成前期产品,12个分中心,产品名称,CYP2D6*10、CYP2C9*3、ADRB1(1165GC)、AGTR1(1166AC)、ACE(I/D)检测试剂盒(基因芯片法),产品标准 YZB/国 4686-2012基因芯片、洗涤母液A、洗涤母液B、阳性参照、阴性参照、杂交液；PCR反应液1、产品性能结 PCR反应液2、PCR反应液3、PCR反应液4、PCR反应液5、酶1、酶2、定位参照。构及组成 产品有效期：A盒：2-8；B盒：-20，有效期6个月。附件：注册产品标准，产品说明书。有效期 2016.10.28批准日期 2012.10.29检测五种基因多态性：CYP2D6*10(CYP2D6*1/*1、CYP2D6*1/*10、产品适用范 CYP2D6*10/*10)、CYP2C9*3(CYP2C9*1/*1、CYP2C9*1/*3、围 CYP2C9*3/*3)、ADRB1(1165G/G、1165G/C、1165C/C)、AGTR1(1166A/A 、1166A/C、1166C/C)、ACE(II、ID、DD)。规格型号 20 人份/套,个体化药物治疗基因芯片/datasearch/face3/base.jsp注册号 国食药监械(准)字2012第3401324号生产单位 湖南宏灏基因生物科技有限公司,开发成熟的个体化药物治疗基因芯片,1. YZYMT-001-A人类KRAS基因突变检测试剂盒（PCR-荧光探针法)12人份/盒,2. YZYMT-002-A人类EGFR基因突变检测试剂盒（PCR-荧光探针法）12人份/盒,3. YZYMT-003-A人类BRAF基因突变检测试剂盒（PCR-荧光探针法）12人份/盒,4. YZYMT-006人类CYP2C19基因多态性检测试剂盒（PCR-荧光探针法20人份/盒,5. YZYMT-007人类CYP2C9和VKORC1基因多态性检测试剂盒（PCR-荧光探针法）20人,份/盒,6. YZYMT-008人类UGT1A1基因多态性检测试剂盒（PCR-荧光探针法)20人份/盒,7. YZYMT-009人类CYP2D6和SULT1A1基因多态性检测试剂盒（PCR-荧光探针法）20人,份/盒,8. YZYMT-010人类TPMT基因多态性检测试剂盒（PCR-荧光探针法)20人份/盒,9. YZYMT-011人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒（PCR-荧光探针法)20人份/盒,我国个体化医学发展三个阶段,基础理论研究,基因导向个体化药物治疗的提出和推动,推动国家管理体系和个体化医疗技术标准化和法规化,年代启,动,年代启,动,年代启,动,疾病相关基因疾病预测与诊断,药物作用相关基因个体化药物治疗,罕见孟德尔遗传病致病基因,常见复杂疾病易感基因,药物代谢/作用基因,药物代谢/作用SNPs,疾病预测-对疾病的新认识和控制,个体化用药-最佳药物反应,伦理、法律、社会问题,分子诊断是实施个体化医学的必需基因检测,发现生物标记假说候选生物标记确证开发原型检测方法,确证候选生物标记临床确证体外诊断试剂分析方法优化和开发管理部门批准,应用各实验室采用审核实验室结果的室间差临床和实验室培训,生物标记和分子诊断方法的发现、确证和应用,BRACAnalysisCampath (坎帕斯 )CD52人源化单克隆抗体Herceptin (赫赛汀)Camptosar (伊立替康 )Gleevec(格列卫)Oncotype DX,乳腺癌判断病情慢性淋巴细胞性白血病选药乳腺癌确定剂量结肠直肠癌判断药物疗效慢性髓细胞性白血病复发风险乳腺癌,基因测序, 风险分析轻微后遗症HER2基因表达UGT1A1多态性分析BCR-ABL荧光定量多变量分析,个体化医学分子诊断临床应用分类及举例疾病易感,Oncotype DX (基因表达谱-21),筛选乳腺癌相关基因临床研究(n=400)验证确定与无转移生存最有关的21个基因,基因表达谱-21试剂盒(RT-PCR技术),结果以复发风险评分(0-100):18分: 低；18-31：中；31：高,250/25000基因多(3)中心临床试验16个癌基因5个癌基因正常表达参考基因(reference genes),胰腺癌分子诊断：PathFinderTG,2010年1月1日启用由于标本量不足，或组织细胞学结果不能肯定作出病理学诊断时的辅助方法。可视为“分子解剖病理学”可确定诊断和预后，也可预测多器官系统的治疗反应检测步骤：1.显微解剖，从病理组织确定和获得异常细胞2.抽提DNA和扩增 (如PCR)3.DNA测序，确认致癌性基因突变4.整合分子诊断结果和病理学家提供的细胞或组织学发现，作出肯定诊断Jian Shen, J, et al, Cancer Cytopathol, 2009;117:21727.,Jian Shen, J, et al, Cancer Cytopathol, 2009;117:21727.,包括3个检测项目：,1. k-ras基因突变,2. 15个抑癌基因杂合性丢失 (LOH) 分析3. 胰腺囊肿液中DNA 质量检定,符合下述标准者定为“异常”,1. k-ras 基因突变,2. LOH 有两个位点突变3. 高质量 DNA,如无上述异常，则定为良性非黏蛋白胰腺囊肿,胰腺癌分子诊断：PathFinderTG,PathFinderTG 分子诊断标准,分子诊断（MDx）良性非黏蛋白囊肿良性黏蛋白囊肿恶性（原位或浸润癌）,标准1. DNA质量低到中等，和：2. 未见k-ras基因点突变，和：3. LOH75%), 或：2. LOH2个位