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,感染控制第一步:把好标本送检关北京地坛医院细菌室 王慧珠,血培养,提升分离及判别是否污染至少收集2套血培养瓶(需氧及厌氧)-儿科做的最好采集时机:用药前，发后、发烧时采集血液成人5至10毫升/瓶，分別打入一套含:厌氧瓶与需氧瓶如果血足，则以需氧瓶为优先,无菌皮肤的准备,血培养瓶口应以75%酒的消毒剂处以采血点为中心，由内往外的方向以安多福进行消毒（几次？）,血管导管尖培养,血管导管尖（intravascular catheter tips ）及腹膜透析导管（peritoneal dialysis catheters ）培养是侦测血感染源方法之一 标准方法是经由导管抽取20ml血液，进血培养；导管周围的皮肤消毒步骤，然后以无菌剪刀取下约5公分长导管尖，置于无菌容器中送检；再由静脉端抽血进另外一套血培养。 实验室将导管尖于培养基上滚动数次后进半定培养，如果菌数大于15 CFU/Tip以上；如果是定培養菌数大于100 CFU/Tip以上， 则认为血感染是可能与导管有关性,导管尖于培养基上滚动数次后进培养，如果菌数小于15 CFU/Tip，可能有意义分离菌白色假丝酵母菌C. albicans黄色葡萄球菌S血管导管尖培养 S. aureus A群链球菌Group A streptococci 革兰氏阴性杆菌Gram negative rods 导管血培养阳性时间较静脉血培养早二小时，可能为与导管引起的血感染 半定琼脂平板保存七天，直到与血培养分离菌相同时，始进药物感受性试验,液培养, 标本收集方法 洁净排泄法(clean-voided):中段液无菌导管收集 耻骨上方穿抽取,尿液标本采集和处理通常留取晨起第一次尿液（此时尿液在膀胱内储存4h以上）；尿液采集后要及时送检，并保证2h之内接种。采集到无菌的15ml离心管中,中段尿采集方法：成年男性和女性分别用肥皂水或1：1000高锰酸钾溶液清洗尿道口和外阴部，再用灭菌水冲洗尿道口，无菌生理盐水冲去消毒液，然后排尿弃去前段尿液，收集中段尿510ml盛于带盖的无菌容器内送检。2导尿法：用导尿管导取1015ml尿液，置灭菌容器中送检；长期留置导尿管者应更换新导尿管留尿；留置导尿时，用无菌消毒法消毒导尿管外部基导尿管口，用无菌注射器通过导尿管抽取尿液送检（不可采集尿液收集袋中的尿液送检）。3集尿法：怀疑结核分枝杆菌感染时，于清洁容器中留取24h尿液，取其沉渣1015ml送检。4耻骨上膀胱穿刺法：培养结果与临床病情矛盾时可采用此法，一般较少应用。5正常人的尿液是无菌的，除外尿道有正常菌群外还有条件致病菌，而这些细菌又是尿路感染中常见的致病菌，故应该注意无菌采集。,痰及下呼吸道标本采集和处理,1自然咳痰法：晨痰为佳，先冷开水洗漱、清洁口腔和牙，尽量排除口腔内杂菌，再用力咳出呼吸道深部的痰，吐至无菌容器中，痰量不得少于4ml。2痰咳出困难时可先雾化吸入NaCl溶液（100g/L加温到45）使痰容易咳出。3查结核分支杆菌，应留取24h痰。4小儿取痰法：用弯压舌板向后压舌，将拭子深入咽部，小儿因压舌板刺激引起咳嗽，喷出的肺或气管分泌物粘在拭子上即可送检。,血液及骨髓培养标本,1血液采集前皮肤消毒程序：75%酒精擦拭静脉穿刺点30秒钟；1%2%碘酊30秒或10%碘伏消毒60秒，从穿刺点向外画圈消毒，直径3cm；75%酒精脱碘；或一步法有效的消毒液（理想的消毒条件下，仍有3%5%污染菌）。,血培养标本采集时间和份数,标本应在抗生素治疗前采集，24h采集23份。对间歇性菌血症，在寒战或体温高峰到来之前采集，因为细菌流入血流与寒战发作通常间隔1h，在发烧时血液可能没有细菌，血培养通常可在寒战或发烧后进行。采集后无菌注入专用培养瓶（成人、儿童、需氧菌、厌氧菌、L型菌需要不同培养瓶）中送检。,支气管盥洗液,分配：细菌室多一些，50ml离心管中,血培养瓶 的消毒,新型隐球菌的特点,新型隐球菌：广泛分布于自然界中，鸽子粪是主要传染源。圆形、卵圆形，菌体为宽厚的荚膜包裹；不形成菌丝和孢子；出芽生殖。分A、B、C、D四个血清型。 A型最多见。致病菌属包括17个种和8个变种，主要是新型隐球菌新生变种和格特变种，已报道引起人类疾病的还有浅黄隐球菌、浅白隐球菌和罗伦隐球菌，但是很少见。,致病性,条件致病菌，免疫功能低下者为高发人群，但也可发生在免疫功能正常人。白血病、恶性肿瘤、艾滋病、SLE、尿毒症患者。长期广谱抗生素、激素、免疫抑制剂使用者更易感染。,临床表现,起病缓慢、可呈亚急性，潜伏期2-4周。脑膜炎的表现：意识障碍，头痛、发热（以不规则热多见）颅内压的表现，可有颅神经损害。未经治疗病情逐渐恶化血常规正常腰穿：压力增高明显，脑脊液外观通明或微混，白细胞轻中度增多（40-400/ul)，以淋巴细胞为主。蛋白轻度升高，糖减低，氯化物轻中度减低。,其他部位隐球菌病,肺隐球菌皮肤隐球菌 骨隐球菌,新型隐球菌对CNS具有亲和力？,机理：可能和脑脊液中有隐球菌所需要的天门冬酰胺、肌酸内酰胺等刺激真菌生长的营养因子有关。隐球菌侵入肺部后，局部病变进展缓慢，病变轻微，常无临床症状，但有20%以上的病例可由此经血进入中枢神经系统，导致隐球菌性脑膜炎的发生。,特殊宿主的隐球菌病,隐球菌病是AIDS病人最重要的也是致命的真菌感染并发症，在AIDS人群中，发病率可达6%10%，而在中部非洲地区可高达15%30%，这可能与发达国家对于AIDS合并机会感染控制水平有关，即早发现、早治疗。AIDS病人患隐球菌病的临床表现与其他免疫受损的病人相似，然而，感染部位常含有更多的菌体，80%以上的病人在做出诊断时已有脑膜炎或脑膜脑炎，且病变厂更广泛。AIDS患者并发隐球菌病很少能治愈，常见持续感染和复发，有文献报道10%25%的病人死于治疗期间。,我院情况,我院2009年1月至2011年12月共确诊405例AIDS患者，其中CNM为53例，感染率13.1%。其中墨汁染色阳性25例（47.2%），真菌培养阳性23例（43.4%），抗原检测阳性53例（100%）。通过单一或联合治疗，治愈1例（1.9%），好转40例（75.5%），未愈6例（11.3%），死亡6例（11.3%）。,诊断,对于临床上出现CNS感染的症状、体征、脑脊液压力明显增高及糖含量明显下降的患者，应高度警惕隐球菌脑膜炎的可能，尤其对具有免疫功能底下者、有养鸽或有鸽粪接触史者，更应高度怀疑。实验室检查具有重要的诊断价值，包含涂片镜检、培养、隐球菌特异性抗原检测和组织病理检查发现隐球菌。,治疗,隐球菌病的治疗包括真菌药物治疗、对症治疗、免疫制剂治疗、手术治疗及原发病的治疗等。抗真菌治疗：两性霉素B(0.5-0.8mg/kg/d)，由1mg/d起渐加量，加入500ml葡萄糖液中避光静脉缓慢滴6h以上；或0.5-1mg脑室引流管缓慢抽吸。氟胞嘧啶（25mg/kg，q6h)。氟康唑（200-400mg/d)/伊曲康唑（100mg bid),治愈标准,连续3次CSF涂片镜检（-）或抗原（-）,实验室检查,一.CSF的涂片二. CSF的墨汁染色（适合脑脊液等体液标本）三. CSF的培养、鉴定、及药敏试验四.隐球菌抗原的检测五.其它标本隐球菌的检测六.组织病理检测,一. CSF的涂片,革兰氏染色：将临床送检的CSF标本1500g离心5分钟，将沉淀物进行涂片、墨汁染色及培养，用上清夜做新型隐球菌抗原的检测。一定要离心(容器要选择能离心的无菌塑料试管，避免二次污染),隐球菌革兰氏染色镜下形态,二. CSF的墨汁染色,方法： 1.用离心后的沉淀物进行墨汁染色。 2.墨汁与脑脊液比例一定要合适。 3.选用优质墨汁。 重视墨汁染色:墨汁染色阳性可以直接向临床报告检测到新型隐球菌。,CSF的墨汁染色隐球菌的形态,取可疑标本置玻片上，加1滴墨汁混匀后加盖片镜检。墨汁染色检测隐球菌对于早期诊断隐球菌性脑炎十分重要，但墨汁染色检测隐球菌镜下形态要注意与单核细胞的区别，隐球菌本身并不被染上墨汁，但在黑色背景下为5-20m，圆或卵圆形，有宽阔透明的荚膜，菌体周边显现为强的折光形成一个折光环，中心部分为折光性较强的颗粒状或条状物质，也能见到单芽孢子，出芽孢子的颈粗细不一，当母子细胞尚未完全分离时同样可见荚膜沟通，无假菌丝。,墨汁染色高倍镜下形态,墨汁染色,墨汁染色,墨汁染色,菌体计数,菌体计数 对中枢系统隐球菌患者，脑脊液菌体计数是判断预后疗效的重要指标。用血细胞计数板计数，在低倍镜下观察，按白细胞计数法计数。,三.真菌培养及鉴定,培养基内可加氯霉素，但不可加放线菌酮，因后者抑制本菌生长。 新型隐球菌 菌落特征 ： SDA25奶油色酵母菌落，有时黄色或带粉色。 显微镜特征: SDA25球菌或椭圆形酵母菌细胞，第一代培养物有时可见小的荚膜。继代培养物不见荚膜。 生理生化检测：用沙氏培养基上分离出的纯菌落制成0.5个麦氏单位悬液，充填API20cAUX真菌鉴定条购自生物梅里埃公司，置35培养24-72h后进行判度。,药敏试验,用ATB FUNGUS3真菌药敏试剂条购自生物梅里埃公司进行药敏测定 。判读标准,四.隐球菌抗原的检测,试剂： 用美国ImmunoMycologics有限公司生产的隐球菌抗原乳胶检测试剂盒进行检测。 说明：该试剂在国内还没有拿到注册证，只能用于科研，并且试剂十分昂贵，凝集的结果要注意判读。,隐球菌抗原的检测,试验原理： 用抗隐球菌抗体包被的乳胶颗粒和存在的隐球菌夹膜多糖抗原的标本反应，发生凝集，对血清标本使用裂解酶处理，减少非特异性干扰。 标本类型：CSF、血清（肺隐球菌病及其它隐球菌病）、支气管盥洗液等。,隐球菌抗原的检测,临床意义 新型隐球菌抗原的检测非常重要，对于早期诊断隐球菌脑炎有重要价值，临床上一部分病人在就诊初期未能及时得到病原学证据，成为本病容易漏诊的最常见原因。目前国外已用乳胶凝集试验代替了一般的墨汁染色，使诊断的敏感性和特异性明显提高，可以达到95%以上。,隐球菌抗原的检测,临床意义： 隐球菌感染的金标准是真菌培养，但敏感性不高，并且隐球菌经过抗生素治疗后很难再培养出来，墨汁染色虽然方法简便，但受菌量多少影响较大，并且治疗后菌体出现退行变，不易辨别。 隐球菌抗原的检测不受送检标本中菌体数量的限制，亦不受药物治疗的影响，可作为活性感染的证据。而新型隐球菌抗原滴度的改变对于临床治疗疗效的观察非常重要。,五.除了CSF外，其它标本的检测,支气管灌洗液：用50ml离心管对标本进行离心，用沉淀物进行涂片、墨汁染色、真菌培养。血培养：抽取10ml血液放到需氧血培养瓶中。,血培养瓶报警后的处理,涂片：注意镜下细菌形态,隐球菌血培养涂片形态,隐球菌血培养涂片形态,血培养瓶报警后的处理,抽取血培养液进行墨汁染色,这样做非常重要，可以立刻向临床报告,能提前4-5天的时间报告。但要注意用血培养进行墨汁染色时，没有用CSF进行墨汁染色时的镜下形态好看，荚膜层要小一些，要注意观察。,血培养的墨汁染色形态,血培养的墨汁染色形态,墨汁染色的比较,六.组织病理检测,有的病变主要由大量繁殖的隐球菌及其引起的炎性细胞浸润构成。由于隐球菌的荚膜物质有抑制中性粒细胞趋化作用，故浸润的炎性细胞是单核细胞、淋巴细胞和浆细胞。损害显示胶样液化，囊腔内有多量隐球菌。有的病变则变现为肉芽的形成，主要由单核细胞、上皮细胞和多核巨细胞等构成。此时隐球菌数目较少，且大部分