心肌细胞及心肌组织RT-PCR protocol by Ps

心肌细胞及心肌组织 RT PCR 实验方案 2 代 CFbs 心肌成纤维细胞 40ml 培养瓶内 瓶底面积约 25mm 换无血清培养基一天 镜下见细胞几乎呈融合状态 实验准备 实验准备 实验前两天开始 浸泡 1 DEPC 用纯水按 0 1 浓度配制 1 1 升 1 升浸泡 100ml 配酒精 2 Tip 10 L 200 L 1ml 多多益善 尤其是 10 L tip 3 EP Tube 1 5ml 多多益善 尤其是需要分装试剂时 4 PCR Tube 200 L 或 500 L 视情况定 5 电泳槽 高温烘烤 160 度 5 个小时 三个饭盒 分别装大枪头 中小枪头 EP 管 三个玻璃瓶 分装异丙醇 氯仿和乙醇 电泳用 1 Agarose 2 Golden View 3 DNA Marker 4 上样缓冲液 0 25 溴酚蓝 0 25 二甲苯青 FF 30 甘油 6 缓冲液 4 保存 5 电泳缓冲液 Tris 54g 硼酸 27 5g 0 5M EDTA 20ml pH8 0 蒸溜水 1000ml 5 TBE 贮存液 再将 5 TBE 稀释 10 倍成 0 5TBE 就可以在电泳时使用 即工作液浓度 如取 50ml 贮存液 450ml 水 500ml 工作缓冲液 其他 PE 手套 实验前一天需要准备 一 引物的配制 1 将所合成的目的基因和内参上下游引物 1OD 用 0 1 DEPC 水溶解 2 根据各个引物分子量的不同 计算加 0 1 DEPC 水的量 使其终浓度均为 20pmol l 质量数 g OD 值 33 分子量 碱基数 324 5 摩尔数 nm 质量数 分子量 加入水量 l 摩尔数 nm 1000 20 3 每条 2 OD 的引物一般可获得 0 5mL 左右的终容积 所以最好分装后于 20 冰箱中冻 存 放置反复冻融 二 预先混合以下试剂 注 中数字为 Takara 试剂盒中编号 11 MgCl2 20 L 8 10 RT Buffer 10 L 5 RNase Free Water 37 5 L 10 dNTP 10 L 以上组成 Mix 液 77 5 L 三 阳性对照 RNA 易降解 置于 80 冰箱中保存 另外 一些蛋白试剂 如酶 需要分装 避免反复冻融 实验当天需要准备 开机预热紫外分光光度计 PCR 仪 水浴箱 60 注意适时将试剂从冰箱中取出 溶解 RNA 提取提取 1 每孔加入 3mlPBS 冲洗 2 遍 直至洗净培养基 如果心肌细胞生长在 40ml 培养瓶 中 则以下所加试剂均需乘以 2 5 2 加 TRIzol 每孔 1ml 3 轻柔的用移液枪吹打几次 4 吸取样品到一个 1 5ml EP 管中 5 室温放置 5 分钟 6 加入 0 2ml 氯仿 chloroform 7 用手剧烈震荡 ep 管 15 秒 充分混匀 8 12000 转 4 离心 10 分钟 可利用三次离心时间配做电泳胶 9 仔细转移上层水相到一个新 EP 管中 注意千万不能贪多 把中间相和有机相吸入 10 加 0 5ml 异丙醇 isopropyl alcohol 11 室温放置 10 分钟 12 12000 转 4 离心 10 分钟 13 去上清 加 1ml 乙醇 14 震荡混匀 15 7500 转 4 离心 5 分钟 16 去上清 简单通风 5 10 分钟干燥 RNA 不能太干 肉眼不能明显看到水分即可 17 加 50 L 无 RNAase 水 吹打数次 18 55 60 水浴 10 分钟 19 下一步实验或冷冻保存 此时可以取出 RT PCR 的试剂盒 准备解冻 RNA 的纯度和浓度检测的纯度和浓度检测 1 预热紫外分光光度计 进口那台 使用应用程序中的 A260 A280 ssDNA RNA 程序 2 用灭活的 DEPC 水 1000 l 调零 3 取 RNA 样品 1 l 加入灭活的 DEPC 水 1000 l 混匀 如果 RNA 浓度过稀 则可适 当减少稀释倍数 改用微量比色杯 4 直接读取 RNA 浓度和 Ratio 并根据稀释情况得出实际的 RNA 浓度 重复操作三次取 平均值 5 RNA 的 Ratio 均在 1 7 2 0 之间 RNA 浓度在 0 5 g l 1 g l 分装 10 l 一管 于 70 冰箱中冻存 RNA 完整性的检测完整性的检测 1 制备琼脂糖凝胶 称取琼脂糖凝胶 0 4g 加入 0 5 TBE 缓冲液 40ml 微波炉加热至 熔化 2 最后配成终浓度为 1 琼脂糖凝胶液体 3 加入 Golden View 2 l 混匀 4 冷却至室温 5 在水平电泳槽上制胶 凝固后浸入 0 5 TBE 缓冲液中 除去样本梳 6 取 1 gRNA 与 1 5 l 甲醛 4 5 l 甲酰胺混合 加入 1 l 上样缓冲液 0 25 溴酚蓝 40 蔗 糖 75mv 电泳至溴酚蓝位于琼脂糖凝胶的 2 3 处 RT PCR 产物电泳分析产物电泳分析 1 取 10 l RT PCR 产物与 2 l 上样缓冲液混合后上样于 1 琼脂糖凝胶 同时以 20 l Ladder 点样 以 0 5 TBE 为缓冲液电泳 2 70V 电泳至溴酚蓝位于琼脂糖凝胶的 2 3 后 紫外灯下观察 扫描 拍照并进行图像 分析 3 图像分析处理系统进行辉度扫描 并以内参校正作相对量分析 数值以两者之积分吸 光度的比值表示 PCR 产物测序 扩增好的目的基因的 PCR 产物 50 l 进行测序 RT PCR 注 中数字为 Takara 试剂盒中编号 1 取出一个 200 LPCR 反应管 顺次加入以下成分 M Mix 液 7 75 L 2 RNase Inhibitor 0 25 L 1 AMV 0 5 L 3 Random 9mers 0 5 L RNA 样品 1 L 以上为 RT 反应体系共 10 L 2 将反应管置入 PCR 仪中 按以下设置参数进行逆转录反应 我已经预设黑 PCR 仪中 Ps RT1 1 程序 30 10min 45 30min 99 5min 5 5min 1 cycle 3 上述逆转录过程完成之后 将此管中另加入以下成分 9 5 PCR buffer 10 L 5 RNase Free Water 28 75 L 6 Takara Taq 0 25 L 上游引物 0 5 L 下游引物 0 5 L 4 重新放入 PCR 仪中按一下方案进行 本实验方案为 ECE 1 其他样品则灵活变通 94 2min 94 30sec 45 51 梯度 40sec40 cycles 72 30sec 72 7min 阳性阳性 RNA 对照对照 RT 部分 M Mix 液 7 75 L 2 RNase Inhibitor 0 25 L 1 AMV 0 5 L 3 Random 9mers 0 5 L 14 positive control RNA 1 L 30 10min 45 30min 99 5min 5 5min 1 cycle PCR 部分 9 5 PCR buffer 1