根系活力的测定

根系活力的测定 根系活力的测定 TTCTTC 法 法 植物根系是活跃的吸收器官和合成器官 根的生长情况和活力水平直接影响地上部的生长和营养状况及产量水本 本实验练习测定根系活力的方法 为植物营养研究提供依据 一 原理 氯化三苯基四氮唑 TTC 是标准氧化电位为 80mV 的氧化还原色素 溶于水中成为无色溶液 但还原后即生成红 色而不溶于水的三苯甲腙 生成的三苯甲腙比较稳定 不会被空气中的氧自动氧化 所以 TTC 被广泛地用作酶试验的 氢受体 植物根系中脱氢酶所引起的 TTC 还原 可因加入琥珀酸 延胡索酸 苹果酸得到增强 而被丙二酸 碘乙酸 所抑制 所以 TTC 还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标 二 材料 设备仪器及试剂 一 材料 水培或砂培小麦 玉米等植物根系 二 仪器设备 1 分光光度计 2 分析天平 感量 0 1mg 3 电子顶载天平 感量 0 1g 4 温箱 5 研钵 6 三角瓶 50ml 7 漏斗 8 量筒 100ml 9 吸量管 10ml 10 刻度试管 10ml 11 试管架 12 容量瓶 10ml 13 药勺 14 石英砂适量 15 烧杯 10ml 1000ml 三 试剂 1 乙酸乙酯 分析纯 2 次硫酸钠 Na2S2O4 分析纯 粉末 3 1 TTC 溶液 准确称取 TTC1 0g 溶于少量水中 定容到 100ml 用时稀释至各需要的浓度 4 磷酸缓冲液 1 15mol L pH7 5 1mol L 硫酸 用量筒取比重 1 84 的浓硫酸 55ml 边搅拌边加入盛有 500ml 蒸馏水的烧杯中 冷却后稀释至 1000ml 6 0 4mol L 琥珀酸 称取琥珀酸 4 72g 溶于水中 定容至 100ml 即成 三 实验步骤 1 TTC 标准曲线的制作 取 0 4 TTC 溶液 0 2ml 放入 10ml 量瓶中 加少许 Na2S2O4粉摇匀后立即产生红色的 甲月替 再用乙酸乙酯定容至刻度 摇匀 然后分别取此液 0 25ml 0 50ml 1 00ml 1 50ml 2 00ml 置 10ml 容量 瓶中 用乙酸乙酯定容至刻度 即得到含甲月替 25 g 50 g 100 g 150 g 200 g 的标准比色系列 以空白 作参比 在 485nm 波长下测定吸光度 绘制标准曲线 2 称取根尖样品 0 5g 放入 10ml 烧杯中 加入 0 4 TTC 溶液和磷酸缓冲液的等量混合液 10ml 把根充分浸没在溶液内 在 37 下暗保温 1 3h 此后加入 1mol L 硫酸 2ml 以停止反应 与此同时做一空白实验 先加硫酸 再加根样品 其他操作同上 3 把根取出 吸干水分 后与乙酸乙酯 3 4ml 和少量石英砂一起在研钵内磨碎 以提出甲月替 红色提取液移入试管 并用少量乙酸乙酯把 残渣洗涤二 三次 皆移入试管 最后加乙酸乙酯使总量为 10ml 用分光光度计在波长 485nm 下比色 以空白试验作 参比测出吸光度 查标准曲线 即可求出四氮唑还原量 四 结果计算 四氮唑还原强度 mg g 根鲜重 h 四氮唑还原量 mg 根重 g 时间 h 植物组织内过氧化物酶植物组织内过氧化物酶 POD POD 活性的测定 实验测试用活性的测定 实验测试用 原理 过氧化物酶广泛存在于植物的各个组织器官中 在有过氧化氢存在的条件下 过氧化物酶可以使愈创木酚氧化 产生茶褐色物质 在 470nm 处有最大吸收峰 可根据单位时间内 A470的变化值 计算 POD 活性大小 仪器 电子天平 冰冻高速离心机 可见光分光光度计 电动玻璃匀浆剂等 试剂 20mM KH2PO4 100mM PBS 取 0 2M Na2HPO4 87 7ml 与 0 2MNaH2PO4 12 3ml 混合 反应液 取 100mM PBS 50ml 加入愈创木酚 28 l 搅拌溶解 待溶液冷却后加入 30 的 H2O219 l 混合均匀保 存于冰箱中备用 方法 1 酶液制备 取 1 0g 植物叶片剪碎 置入玻璃匀浆杯中 加入预冷的 20mM KH2PO45ml 进行冰浴研磨提取 匀浆液 低温离心 8500rpm 15min 上清液为酶粗提液 定容到 50ml 供测定 2 酶活性测定 取光程为 1cm 的玻璃比色杯 2 只 一只加入反应液 3ml 20mM KH2PO41ml 作为调零管 另一只加入 反应液 3ml 提取的酶液 1ml 立即开始计时 在 470nm 波长处进行比色 开始记录数据 然后每隔一分钟记录一次 吸光度值 共测 3min 3 计算 以每分钟 A470的化变值 0 01 为一个相对酶活单位 计算植物组织内过氧化物酶酶活力的大小 单位 U g 鲜重 过氧化氢酶测定 过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中 其活性与植物的代谢强度及抗寒 抗病能力有一定关系 故常加以测 定 一 原理 过氧化氢酶 catalase 属于血红蛋白酶 含有铁 它能催化过氧化氢分解为水和分子氧 在此过程 中起传递电子的作用 过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂 可根据 H2O2的消耗量或 O2的生成量测定该酶活力大小 在反应系统中加入一定量 反应过量 的过氧化氢溶液 经酶促反应后 用标准高锰酸钾溶液 在酸性条件下 滴定 多余的过氧化氢 即可求出消耗的 H2O2的量 二 材料 仪器设备及试剂 一 材料 小麦叶片 二 仪器设备 1 研钵 2 三角瓶 3 酸式滴定管 4 恒温水浴 5 容量瓶 三 试剂 1 10 H2SO4 2 0 2 mol L pH7 8 磷酸缓冲液 3 0 1mol L 高锰酸钾标准液称 取 KMnO4 AR 3 1605g 用新煮沸冷却蒸馏水配制成 1000ml 再用 0 1mol L 草酸溶液标定 4 0 1mol L H2O2市售 30 H2O2大约等 于 17 6mol L 取 30 H2O2溶液 5 68ml 稀释至 1000ml 用标准 0 1mol L KMnO4溶液 在酸性条件下 进行标定 5 0 1mol L 草酸 称取优级纯 H2C2O4 2H2O 12 607g 用蒸馏水溶解后 定容至 1000ml 四 实验步骤 一 酶液提取 取小麦叶片 2 5g 加入 pH7 8 的磷酸缓冲溶液少量 研磨成匀浆 转移至 25ml 容量瓶中 用该 缓冲液冲洗研钵 并将冲洗液转至容量瓶中 用同一缓冲液定容 4000rpm 离心 15min 上清液即为过氧化氢酶的粗 提液 二 取 50ml 三角瓶 4 个 两个测定 另两个为对照 测定瓶加入酶液 2 5ml 对照加煮死酶液 2 5ml 再加 入 2 5ml 0 1mol L H2O2 同时计时 于 30 恒温水浴中保温 10min 立即加入 10 H2SO42 5ml 用 0 1mol L KMnO4标准溶液滴定 至出现粉红色 在 30min 内不消失 为终点 五 结果 酶活性用每 g 鲜重样品 1min 内分解 H2O2的 mg 数表示 过氧化氢酶活性 H2O2mg g min A B VT W VS 1 7 t 式中 A 对照 KMnO4滴定 ml 数 B 酶反应后 KMnO4滴定 ml 数 VT 提取酶液总量 ml VS 反应时所用酶液量 ml W 样品鲜重 g t 反应时间 min 1 71ml0 1mol L KMnO4相当于 1 7mgH2O2 超氧物歧化酶 SOD 活力 一 原理 超氧物歧化酶 superoxidedismutase SOD 普遍存在于动 植物体内 是一种清除超氧阴离子自由基的酶 本 实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑 NBT 在光下的还原作用来确定酶活性大小 在有氧化物质存在下 核黄素可 被光还原 被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生 O2 可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙 后者在 560nm 处有 最大吸收 而 SOD 可清除 O2 从而抑制了甲腙的形成 于是光还原反应后 反应液蓝色愈深 说明酶活性愈低 反之 酶活性愈高 据此可以计算出酶活性大小 二 材料 仪器设备及试剂 一 材料 水稻或小麦叶片 二 仪器设备 1 高速台式离心机 2 分光光度计 3 微量进样器 4 荧光灯 反应试管处照度为 4000Lx 5 试管或指形管数支 三 试剂 1 0 05mol L 磷酸缓冲液 pH7 8 2 130mmol L 甲硫氨酸 Met 溶液 称 1 9399gMet 用磷 酸缓冲液定容至 100ml 3 750 mol L 氮蓝四唑溶液 称取 0 06133gNBT 用磷酸缓冲液定容至 100ml 避光保存 4 100 mol L EDTA Na2溶液 称取 0 03721gEDTA Na2用磷酸缓冲液定容至 1000ml 5 20 mol L 核黄素溶液 称 取 0 0753g 核黄素用蒸馏水定容至 1000ml 避光保存 三 实验步骤 1 酶液提取 取一定部位的植物叶片 视需要定 去叶脉 0 5g 于预冷的研钵中 1ml 预冷的磷酸缓冲液在冰 浴上研磨成浆 加缓冲液使终体积为 5ml 取 1 5 2ml 于 1000rpm 下离心 20min 上清液即为 SOD 粗提液 2 显色反应 取 5ml 指形管 要求透明度好 4 支 2 支为测定管 另 2 支为对照管 按下列加入各溶液 试剂 酶 用量 ml 终浓度 比色时 0 05mol L 磷酸缓冲液 1 5130mmol L Met 溶液 0 313mmol L 750 mol L NBT 溶 液 0 375 mol L 100 mol L EDTA Na2液 0 310 mol L 20 mol L 核黄素 0 320 mol L 酶液 0 052 支对照管以缓 冲液代替酶液蒸馏水 0 25 总体积 3 0 混匀后将 1 支对照管置暗处 其它各管于 4000Lx 日光下反应 20min 要求各管 受光情况一致 温度高时间缩短 低时延长 3 SOD 活性测定与计算 至反应结束后 以不照光的对照管做空白 分别测定其它各管的吸光度 四 结果计算 已知 SO