Wnt信号相关胞外拮抗因子遗传变异与胃癌易感性的关联性及相关功能学研究.doc

Wnt信号相关胞外拮抗因子遗传变异与胃癌易感性的关联性及相关功能学研究 t Wnt信号相关胞外拮抗因子遗传变异与胃癌易感性的关联性及相关功能学研究背景与目的:我国是胃癌的高负担国家。 据最新统计数据显示,胃癌在我国男性肿瘤发病率中位居第二位,仅次于肺癌;在女性中位列第三位,仅次于乳腺癌和肺癌。 尽管早期胃癌经手术治疗后,五年生存率达到90%左右,但早期胃癌往往缺乏典型临床症状,大多数患者确诊时已进入中晚期,错过最佳治疗时期,导致胃癌在人群中的死亡率较高(胃癌占肿瘤死因的第二位)。 阐明影响胃癌发生相关危险因素,并积极采取三级预防控制措施对防治胃癌发生具有重要的公共卫生学意义。 胃癌是一种与环境密切相关的肿瘤。 幽门螺旋杆菌感染、腌制食品、硝酸盐、多环芳烃化合物、烟草与酒精等暴露都被证实与胃癌的发生有关。 近年来,有越来越多的研究表明,处于相同的环境暴露下,不同遗传背景的个体之间胃癌的易感性也存在差异,说明遗传因素也是影响胃癌发生的重要因素。 这种遗传性差异在人群中更多的表现为单核苷酸多态性(SNP)。 全基因组关联研究(GWAS)是一种高效的用于筛选遗传易感位点的研究策略,相关胃癌GWAS发现3q13.31(rs9841504)、5p13.1(rs13361707)区域是中国人群胃癌的易感区域。 但GWAS阳性位点大多位于无生物学功能的区域,对此存在的统计学关联仍然难以解释;此外GWAS通常采用较高的统计学检验水准(P10%的位点。 对于位于3非翻译区位点,利用在线SNP功能分析预测网站SNPinfo(snpinfo.niehs.nih/snpinfo/snpfunc.htm)选择吉布斯自由能(Energy)绝对值大于20的miRNA;构建pGL3-promoter-SNP重组质粒,合成miRNA模拟物(mimics)及阴性对照miRNA(negative control)。 将包含不同等位基因的质粒及内对照质粒PRL-SV40瞬时转染至人胃癌细胞株MGC803中同时共转染miRNA模拟物或阴性对照miRNA,使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各组萤火虫/海肾荧光相对比值,探讨miRNA与SNP位点间的调控关系。 我们基于癌症基因图谱The CancerGenome Altas(TCGA)(s:/gdc-portal.nci.nih/),TCGA-STAD项目RNA-seq数据,并联合患者人口学信息、临床病理学特征探讨DKKs和sFRP1在胃癌与癌旁组织样本中mRNA表达量的差异以及mRNA表达对预后的影响,并利用胃癌新发病例组织样本进行验证,初步推测DKKs和sFRP1在胃癌发生和预后中潜在的生物学功能。 病例组和对照组间人口学特征比较采用t检验和2检验;拟合优度2检验用于分析各SNP在对照人群中是否符合Hardy-Weinberg平衡;多因素Logistic回归模型用于计算年龄与性别调整的比值比(OR值)及其95%可信区间;采用Bonferroni法进行组内多重比较校正;采用基于2分布的Q检验估计各亚组间的异质性;PHASE2.0用于单倍型的构建;Quanto software用于统计学把握度的计算;TCGA数据整合和转换采用Perl脚本。 运用SPSS21.0(International BusinessMachines Corp.,IBM)进行数据管理,SAS9.1.3(SAS Institute,Inc.,Cary,NC,USA)软件进行统计分析。 研究结果: 1、本研究在DKKs中共筛选出6个SNP位点:rs2241529(AG)、rs3733635(TC)、rs17037102(GA)、rs419764(CT)、rs3206824(GA)、rs2073664(CT)。 对这六个SNP位点在病例组和对照组中分别进行基因分型,并没有发现两组间存在显著性的差异(P0.05)。 2、sFRP1中筛选出2个位于3非翻译区的SNP位点rs1127379和rs10088390。 sFRP1rs1127379三种基因型(AA、AG、GG)在对照组中的分布频率为37.1%、46.1%以及16.8%;在病例组中为42.7%、46.3%以及11.0%。 经双侧2检验,发现这三种基因型在病例组与对照组中的分布有显著的统计学差异(2=7.652,P=0.022)。 经调整年龄性别后,Logistic回归模型分析发现与AA基因型相比较,携带GG基因型与胃癌风险的降低显著相关(OR=0.53,95%CI:0.35-0.81);同时,与携带A等位基因的个体(AA/AG)相比,隐性模型亦与胃癌风险的降低显著关联(OR=0.55,95%CI:0.37-0.81)。 基于研究的样本含量,检测到OR=0.53的统计学把握度达到91.66%,OR=0.55时的统计学把握度为88.66%。 把握度计算相关参数设置为:rs1127379的G等位基因频率为0.4530,胃癌中国人群患病率估计(31.8/100000),遗传模型则为隐性模型。 3、对胃癌的病理类型和原发部位进行分层分析,rs1127379这种保护性作用在肠型胃癌(OR=0.53,95%CI:0.34-0.84)与非贲门型胃癌中(OR=0.52,95%CI:0.33-0.82)仍然存在的。 而在弥漫型胃癌与贲门癌中则未发现这种显著性关联(P0.05)。 4、根据年龄、性别、吸烟和饮酒状况进行分层,进一步探讨分析rs1127379位点的风险效应。 研究发现无论是高龄组还是低龄组,携带GG基因型的个体与携带A等位基因的个体相比,均与胃癌风险的降低显著相关(低龄组:调整OR=0.50,95%CI:0.26-0.94;高龄组:调整OR=0.57,95%CI:0.35-0.94),且两者之间同质性较好(异质性检验P=0.66)。 在男性中,携带GG基因型个体与胃癌风险的降低显著相关(调整OR=0.46,95%CI:0.29-0.73);在饮酒者中,与胃癌风险的下降具有显著性的关联(调整OR=0.26,95%CI:0.08-0.88);在吸烟者中,GG基因型亦与胃癌风险的降低具有显著的关联(调整OR=0.21,95%CI:0.09-0.47)。 5、sFRP13非翻译区SNPrs10088390三种基因型CC、CG、GG在病例和对照组的分布分别为35.1%、47.0%、17.9%以及37.0%、46.9%、16.1%。 两组之间分布经双侧2检验无显著性统计学差异(P=0.708)。 6、利用PHASE2.0将sFRP1两个位于3非翻译区的SNP位点rs1127379与rs10088390构建单倍型。 结果推断出4种单倍型,分别是Ars1127379Crs10088390,Ars1127379Grs10088390,Grs1127379Grs10088390以及Grs1127379Crs10088390。 与频数最多的A rs1127379C rs10088390相比,A rs1127379Grs10088390与胃癌风险升高具有显著关联(OR=2.54,95%CI:1.76-3.67)。 7、通过SNPinfo预测网站发现miRNA-1182可特异性地与sFPR1rs1127379位点A等位基因结合,且吉布斯自由能绝对值大于20。 采用双荧光报告基因实验探讨miRNA-1182与rs1127379AG位点间的调控关系。 结果显示sFRP1rs1127379AG改变可影响miRNA1182对其的调控作用。 8、癌症基因图谱TCGA27对胃癌与癌旁组织mRNA表达差异比较发现DKK2mRNA在胃癌组织中的表达水平显著地高于相应的癌旁组织(P=0.007);DKK4mRNA在胃癌组织中的表达水平则显著地低于相应的癌旁组织(P0.05)。 生存分析发现DKK1低表达组的五年生存率显著的高于高表达组(P=0.0086)。 sFRP1mRNA在胃癌组织中的表达水平显著地低于相应的癌旁组织(P0.05)。 研究结论:DKKs潜在功能性SNP位点(rs2241529(AG)、rs3733635(TC)、rs17037102(GA)、rs419764(CT)、rs3206824(GA)、rs2073664(CT)可能与胃癌的发生风险无显著性关联,同时未发现这些SNP位点与人口学特征、胃癌病理分型以及发病部位有关;sFRP1rs10088390(CG)多态与胃癌发病风险没有显著性关联;sFRP1rs1127379GG基因型与肠型胃癌以及非贲门胃癌的发生风险有关,且该位点改变可影响miRNA-