β蚕感撩讯Aβ142诱导星形胶质细胞活化所致PC12细胞损伤的保护作用研究.doc

蚕感撩讯A142诱导星形胶质细胞活化所致PC12细胞损伤的保护作用研究 蚕感撩讯A142诱导星形胶质细胞活化所致PC12细胞损伤的保护作用研究摘要该文探讨细辛醚对A142诱导星形胶质细胞活化所致PC12细胞损伤的保护作用及其机制，为细辛醚在阿尔兹海默病（Alzheimers diease，AD）防治中的应用提供实验依据。 首先，采用实时无标记动态细胞分析技术（Real timecell analysis，RTCA）构建RAh/PC12共培养体系，实时动态观察A142诱导星形胶质细胞损伤后对共培养体系中PC12细胞存活率的影响，根据系统自动生成的存活率曲线和参数选出最佳的药物干预时间，采用不同浓度的细辛醚对星形胶质细胞进行干预，观察共培养体系中PC12细胞存活率的改变；其次，采用MTT法检测A142作用于RAh对PC12细胞存活率的影响以及细辛醚的干预效应，验证RTCA的检测结果；进一步采用ELISA法检测下室培养液中IL1，TNF，BDNF的水平；Western blot法检测PC12细胞NFB的活性和ERK，p38，JNK磷酸化水平。 结果显示，细辛醚（555mg?L-1）能显著减缓A142诱导的RAh活化引起的PC12细胞存活率下降（P关键词细辛醚；A142；星形胶质细胞；PC12细胞；RTCA；NFBAbstractThis studywas aimedto investigatethe protectiveeffect andmechanism ofasarone on PC12cells injuryinduced byA142activated astrocytes，and provideexperimental basisforasarone applicationin theprevention andcontrol of Alzheimers disease（AD）Firstly，RAh andPC12cells werecocultured inthe specialtranswell chamber，and theReal timecell analysis（RTCA）system was used torealtime observeits effecton PC12cells survivalrate inthe coculturesystem afterastrocytes injuryinduced by A142.The bestintervention timeofasarone wasselected aordingto thesurvival curveand parametersgenerated automaticallyasarone withdifferent concentrationswas usedfor interventionon astrocytes，then thechanges ofPC12cells survivalrate inthe coculturesystem wereobserved Secondly，MTT assaywasusedto detectthe effect ofA142onPC12cells survivalrate aswell asthe interventioneffectofasarone，and verifythe testingresults ofRTCA Thelevels ofIL1，TNFand BDNFin culturemedia ofthe lowerchamber were detected byELISA TheNFB activityand phosphorylationlevels ofERK，p38and JNKweredetectedby Westernblot Resultsshowed thatasarone（555mg?L-1）could significantlyslowdown thedecline ofPC12cells survivalrate causedbyA142induced RAhactivation（PKey wordsasarone；A142；astrocyte；PC12cell；RTCA；NFB doi10.4268/cjcmmxx0720近年来研究发现，星形胶质细胞作为中枢神经系统最丰富的细胞群，与阿尔兹海默病（Alzheimers diease，AD）的发生发展密切相关。 AD早期可出现广泛、持续的星形胶质细胞激活1，其发展过程中脑内始终存在着以星形胶质细胞激活为特征的炎症反应。 激活的星形胶质细胞产生并释放大量炎症因子和神经营养因子等，起初可进行自身保护，修复受损组织，保护神经元，持续的炎症反应则加剧A的生成，加速神经元的损伤，诱发AD2。 本实验通过构建星形胶质细胞和PC12细胞的共培养体系作为研究对象，能很好地模拟脑内微环境，较之于体外研究神经系统疾病的单一细胞模型具有一定的优势。 石菖蒲为天南星科植物石菖蒲Acorus tatarinowiiSchott的干燥根茎，具有开窍豁痰、醒神益智的功效，临床上广泛应用于癫痫、健忘、耳鸣、中风失语、老年性痴呆等病症3。 细辛醚为石菖蒲的主要有效成分，其对淀粉样蛋白诱导的PC12细胞凋亡具有抑制作用45，对AD模型大鼠海马神经元凋亡有一定的保护作用67。 本课题组前期研究发现，细辛醚对A142诱导活化的星形胶质细胞损伤有保护作用。 但细辛醚的作用与A活化的星形胶质细胞对PC12细胞的影响尚未见报道。 本文在前期实验的基础上，研究细辛醚对A142诱导星形胶质细胞活化所致PC12细胞损伤的保护作用，为细辛醚在AD防治中的应用提供实验依据。 1材料荧光倒置显微镜（德国莱卡公司，型号DMI3000B）；CO2培养箱，生物安全柜（德国Thermo公司，型号分别为3111，1300Series A2）；酶标仪（美国BIOTEK仪器公司，Power WaveX340）；台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司，Centrifuge5430R）；电泳仪（美国BioRad公司，型号PowerPac Basic1645050）；双色红外激光成像系统（美国LICOR公司，型号ODYSSEY）；实时无标记细胞功能分析仪DP系统（杭州艾森生物有限公司，CA92121）。 细辛醚（纯度98%，金坛市威德龙化学有限公司，批号120MB711V）；A142（上海吉尔生化有限公司，批号052487）；DMEM高糖培养基，胎牛血清，025%胰酶（美国Gibco公司，批号分别为8114420，1581730，1606137）；MTT（美国Amresco公司，批号2273C305）；大鼠IL1ELISA试剂盒，大鼠TNFELISA试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司，批号分别为AB07AD0276，AB07AD0277）；大鼠BDNF ELISA试剂盒（上海信帆生物科技有限公司，批号xx05）；NFB p56抗体（美国Abcam公司，批号GR2093561）；p38MAPK，pp38MAPK，ERK，pERK，JNK，pJNK抗体（Cell SignalingTechnology公司，货号分别为8690s，4511s，4695s，4370s，9528，4668）；Lamin B1抗体（美国ImmunoWay公司，批号B3601）；GAPDH抗体（Santa Cruz公司，批号B0514）；羊抗鼠二抗，羊抗兔二抗（美国LICOR公司，批号分别为C205315，C4010904）；BCA蛋白定量试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司，批号xx0623）；细胞核蛋白与胞浆蛋白提取试剂盒（Beyotime公司，批号0301061503）；细胞全蛋白提取试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司，批号Kap2100）；BSA（美国Life公司，批号A925BA0016）；PVDF膜（美国BioRad公司，批号16xx7）。 RAh大鼠海马趾星形胶质细胞购自上海斯信生物科技有限公司；高分化PC12细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所。 2方法21药物与试剂的配制细辛醚混悬液称取一定量的细辛醚粉末溶于100L DMSO中配制成母液（保证母液配制成所需最高药物浓度后DMSO的量在终体积01%以下），-20保存，备用。 依据课题组前期实验结果，本文采用1667，555，185mg?L-1作为实验剂量（给药前用PBS稀释成所需浓度）；A142溶液将A142寡聚体溶于100L无菌PBS中，现配现用。 给药前取一定量稀释至所需浓度即可。 22细胞培养RAh培养基为含10%胎牛血清和1%青链霉素溶液的DMEM高糖培养基，于5%CO2，37恒温细胞培养箱中培养，待细胞长至80%满度时，025%胰酶消化，13进行传代。 PC12细胞培养基为含5%胎牛血清和1%青链霉素溶液的DMEM高糖培养基，其余同RAh。 23共培养体系的建立向Eplate16板中加入空培养基测定基线，取对数生长期的PC12细胞，分别以125105，25105，5105，1106个/mL的浓度接种于Eplate16板，每孔100L（每个浓度4个复孔）。 培养箱内放置30min后检测，根据仪器自动生成的阻抗（CI）值和增殖曲线，确定PC12细胞的最佳接种密度；而后将不同浓度（0，25104，5104，1105个/mL）RAh接种于Eplate Insert16上室（各4孔，孔径04m），单独培养至贴壁后放入Eplate16，与PC12共培养，根据2种细胞的最佳接种浓度，建立共培养体系。 24细胞模型的制备、分组及给药241细胞模型的制备首先，取不同浓度A142（33，10，30mol?L-1）作用于共培养体系的上室（RAh），观察共培养体系下室中PC12细胞的增殖曲线，并设置上室中不含星形胶质细胞的对照实验（含Insert），选取最强作用的A142浓度，制备细胞模型。 4讨论石菖蒲是广泛应用于中枢神经系统疾病治疗的中药，具有神经元保护、改善学习记忆等作用。 细辛醚为石菖蒲的主要活性成分之一，在体内吸收分布快，且极易通过血脑屏障。 本课题组前期研究发现，细辛醚对东莨菪碱所致的学习记忆获得障碍、对亚硝酸钠所致的记忆巩固障碍及乙醇所致的记忆再现障碍模型小鼠均有改善记忆的作用，对A2535所致的PC12细胞损伤有抗凋亡作用，对A142诱导星形胶质细胞活化所致的损伤有保护作用，显示出良好的研究前景。 星形胶质细胞作为中枢神经系统内分布最广的细胞，与神经元之间存在复杂的相互作用，其激活介导的神经系统炎症反应在神经退行性疾病的发病和发展过程中起着重要的作用8。 研究发现9AD患者脑中存在大量激活的星形胶质细胞，围绕在神经炎性斑块周围。 A可以引起星形胶质细胞的活化，活化的星形胶质细胞中含有A片段，为其在A的降解中发挥作用。 这些结果均表明星形胶质细胞在AD中发挥重要作用。 适度激活的星形胶质细胞可胞吞A蛋白，释放神经营养因子，保护神经元；但过度激活的星形胶质细胞，通过释放神经毒性的细胞因子和其他毒性物质，诱导神经元凋亡，加速AD病理进程。 本实验通过构建星形胶质细胞和PC12细胞的共培养体系，更好地模拟脑内微环境和2种细胞相互作用的关系。 将细辛醚作用于A142活化的RAh细胞，观察与其共培养的PC12细胞存活率的变化。 结果发现，10mol?L-1A142作用24，48h均能使PC12细胞的存活率显著下降，细辛醚（555mg?L-1）能显著提高PC12细胞的存活率。 细辛醚能有效地抑制A142诱导RAh活化导致的PC12细胞存活率下降，保护PC12细胞。 实验从抑制炎症角度，研究细辛醚发挥保护作用的初步机制。 A寡聚体作用于星形胶质细胞，可使星形胶质细胞释放大量炎症因子，如IL1，IL6，TNF，IL8，活性氧等，作为初始的典型炎症反应，这些物质对神经元有毒性作用，促使神经元凋亡1011。 前期实验研究发现细辛醚能抑制A142活化的星形胶质细胞IL1，TNF的表达。 本实验采用不同浓度的细辛醚处理A142活化的星形胶质细胞，结果发现细辛醚（555mg?L-1）能有效降低共培养下室中IL1，TNF水平。 Kimura等研究发现，在AD早期可发现星形胶质细胞对A的反应性增强，A可诱导星形胶质细胞产生脑源性神经营养因子（BDNF），促进神经元损伤后的存活和修复1214，减轻A所致神经毒性。 本实验研究发现，细辛醚（1667mg?L-1）能促进BDNF的释放。 介导炎症最主要的通路为NFB通路，AD的发生机制与其转录因子的活性调节密切相关，持续的炎症和氧化应激等引起的NFB过度激活会加剧炎症反应和氧化应激，促进神经元的凋亡；另一条介导炎症的主要信号通路是MAPK通路，包括细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signalregulatedkinase，ERK），cJun氨基末端激酶（cjun NH2terminal kinase，JNK）和p38丝裂原活化蛋白激酶（p38mitogen activatedprotein kinase，p38），一旦MAPK被磷酸化而激活，它可以进一步磷酸化并激活其他激酶或转录因子，如NFB和AP1等15。 本课题组前期实验结果表明，细辛醚能抑制星形胶质细胞p38，ERK的磷酸化水平等。 本实验研究发现，细辛醚（555mg?L-1）能有效抑制下室PC12细胞的NFB活性和ERK，JNK的磷酸化水平。 综上所述，细辛醚可能通过促进BDNF的释放，降低IL1，TNF的水平和ERK，JNK的磷酸化水平，以及抑制PC12细胞NFB活性而起到保护作用。 参考文献1Carter SF，Scholl M，Almkvist O，et al.Evidence forastrocytosis inprodromal Alzheimerdisease providedby11CdeuteriumLdep