超声遗传学技术中的机械敏感性离子通道.doc

超声遗传学技术中的机械敏感性离子通道 浙江大学学报(医学版)JOURNAL OFZtlEJIANG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCES)2019年2月February2019zjujournalsmedDOh1037850issn1008-929220190206超声遗传学技术中的机械敏感性离子通道洪非凡-，李月舟m1浙江大学医学院生物物理系，浙江杭州3100582浙江大学医学院附属儿童医院实验检验中心，浙江杭州310052摘要超声遗传学技术是一种非侵入性神经调控手段。 机械敏感性离子通道*-J-矿2被低强度的超声激活而开放，达到调节可兴奋性细胞活性的目的，避免高强度超声对组织器官可能造成的损害。 本文着重介绍了大电导机械敏感性离子通道、瞬时受体电位通道、双孔钾通道、Piezo等机械敏感性离子通道在超声神经调控中的研究进展及其应用，以期为超声遗传学研究提供参考。 关键词离子通道；电生理学；超声检查；神经生理学；神经元；综述Q71文献标志码AApplication ofmechanosensitive channelsin sonogeicsHONGFeifanl，LI Yuezhoul2nDepartment ofBiophysics，Zhejiang UniversitySchool ofMedicine，Hangzhou310058,China；2Department ofLaboratory,Childrens Hospital，Zhejiang UniversitySchool ofMedicine，Hangzhou310052，China)Corresponding authorLIYuezhou，E-mail000305824255yuezhou-lizjuedu，sorcid,org0000-AbstractAs anon-invasive approach，sonogeics is applied tocontrol neuronalactivityThe mechanosensitive channel(MSC)。 which haslowthreshold ofresponding toultrasoundmay bethe alternativesolutionSonogeics iSthe techniquethat activatestheMSC expressedin targetedneurons by10W intensityultrasoundthus achievetheneuromodulationIn thisreviewwe introducethe mechanosensitive channel oflargeconductance，transient receptorpotential，channels of the two-poredomain potassiumfamily，Piezo andthe recentprogress ontheir applicationin sonogeicsKey wordsIon channels；Electrophysiology；Ultrasonography；Neurophysiology；Neurons；ReviewJ ZhejiangUniv(Med Sci)，2019，48 (1)34-38专题报道2018-0821接受日期20180923基金项目国家自然科学基金(81527901，31270878)第一作者洪非凡(1995一)，男，硕士研究生，主要从事超声神经调控研究；E-mailhongfeifanhffqqcorn；sorcidorg0000-0003-3792-906X通信作者李月舟(1972一)。 男。 博士，研究员，主要从事机械敏感性离子通道的功能和机制研究；Emailyuezhou-lizjueducasorcidor4255万方数据洪非凡，等超声遗传学技术中的机械敏感性离子通道35脑功能和脑疾病是我们了解自身奥秘所面临的重要挑战，神经调控技术在该领域研究中发挥了巨大作用，包括深层脑刺激技术、经颅磁刺激技术和光遗传学技术等?。 但这些技术存在诸多限制，如刺激部位的深浅度较难把握、空间分辨率低等。 此外，这些技术操作中需要进行手术植入光纤或电极等，不可避免地会对机体造成损害。 二十世纪五十年代，Fry等乜1通过改变超声波的频率、脉冲重复频率、脉冲宽度、持续时间及强度等参数来调节神经元细胞的活性，这就是超声神经调节技术。 经过几十年的发展，超声神经调节技术已经有了很大的进展。 Foster等口1利用超声刺激猫的耳蜗和听觉神经，引发动作电位产生和神经元活化；Tyler等H1研究发现，超声可以刺激脑片上的电压门控离子通道开放产生动作电位；Deffieux等b利用聚焦式超声(FUS)干扰猕猴大脑前叶的活动；Legon等1用FUS靶向刺激初级躯体感觉皮层影响人感官辨IIII力等大脑活动，说明FUS可以应用于调节局部的人大脑皮层功能。 与其他方法相比，超声可以无损伤穿过颅骨，深入脑组织，聚焦到不同深度的脑区，具有时空上的可控性和精确性。 但是，超声神经调节技术也并非绝对安全，如超过40MPa的超声强度会引起大脑等柔软组织空化损伤n3，因此为了达到通过超声精确控制神经活动的目的，需要找到一种介质可以在神经元表达并赋予神经元灵敏的超声敏感性。 机械敏感性离子通道可以被低强度的超声激活而开放，达到调节可兴奋性细胞活性的目的，避免高强度超声对组织器官可能造成的损害。 这种利用机械敏感性离子通道等作为媒介来调节神经活动的方法被称为超声遗传学随，其原理与光遗传学相似，都是通过分子生物学技术将机械敏感性离子通道基因转到特定脑区并诱导表达，超声波刺激引起这些脑区神经元细胞膜上的机械敏感性离子通道开放或者关闭，改变膜电位，激活或者抑制神经元细胞。 细菌细胞内的机械敏感性离子通道主要有大电导机械敏感性离子通道(mechanosensitivechannel oflarge conductance，MscL) 91、小电导机械敏感性离子通道、钾离子调控的小电导机械敏感性离子通道、微小电导机械敏感性离子通道等。 动物体内常见的机械敏感性离子通道可以分为四类瞬时受体电位(transient receptorpotential，TRP)离子通道家族、Piezo离子通道家族、上皮钠通道臌敏感性离子通道家族、双孔钾通道家族(channels ofthe two-pore-domain potassiumfamily，K2P)。 虽然机械敏感性离子通道的种类很多，但因发展历史尚短，目前仅有几类机械敏感性离子通道应用于超声遗传学研究。 本文就这几类机械敏感性离子通道在超声神经调控中的研究进展作一简介，以期为超声遗传学技术发展提供参考。 1大电导机械敏感性离子通道及其在超声遗传学中的研究进展细菌MscL是研究机械敏感性离子通道的模型，目前对其结构以及开放机制等已有较为深入的了解。 MscL由5个相同亚基构成，每个亚基含136个氨基酸残基；亚基中有2个跨膜仅螺旋区(TMl和TM2)及一个位于胞外连接2个跨膜区的环区，氨基端和羧基端都位于细胞质一侧。 5个亚基TMl共同组成孔道部分，TM2与细胞质膜的脂双层相互作用，感受质膜的张力而使MscL通道打开；MscL不具有离子选择性，允许钠离子、钾离子以及葡萄糖等小分子有机物通过孔道。 MscL作为细菌的生物应急释放阀存在，当周围环境渗透压急剧降低，细菌迅速开放MscL离子通道，释放钾离子及谷氨酸盐等溶质，降低胞内渗透压以避免吸水涨破n0I。 机械压力等导致细胞膜的张力发生改变，TM2接受信号刺激后引起TMl顺时针旋转100。 插入脂双层结构中，开放一个直径为3nm的孔道，此时直径小于3nm的分子即可通过“121。 Doemer等n引首次在哺乳动物细胞中表达MscL野生型和MscL G22C突变体，验证了原核生物的MscL通道可以在哺乳动物细胞中发挥作用；Heureaux等n41利用声镊技术(acoustic tweezingcytometry)，添加具有放大超声刺激作用的微泡到细胞表面使之与整联蛋白受体牢固结合，超声刺激后使MscL开放；更进一步的研究发现声镊技术调节MscL的活性依赖于细胞骨架及细胞表面的整联蛋白受体。 Ye等H副在原代培养的大鼠海马神经元中表达MscL，不需要微泡介导，低强度的超声波刺激可以直接激活这些神经元细胞(图1)，且MscL对神经元原本的电生理特征和存活情况并无影响。 MscL192L(功能获得性突变)对超声波响应更为敏感，使用更低强度的超声(025MPa)即可引发神经元动作电位的发生，单个动作电位由短脉冲产生，且这种兴奋性可控，为神经的精准调控提供了万方数据36浙江大学学报(医学版)Journal ofZhejiang University(Medical Sciences)口-关闭尊开放超声波蔗hkp，。 j摹超声波刺激海马神经元使细胞膜上的MscL通道开放，离子通过该孔道进出细胞，电生理方法检测到神经元动作电位MscL大电导机械敏感性离子通道图1超声波调控神经活性的机制5Figure lMechanismof ultrasonicregulation of neural activity很好的方法。 超声调节MscL在神经元上的激活，为超声遗传学提供了一个新的超声作用受体通道。 与其他机械敏感性离子通道相比，MscL有很多优势，如序列结构、遗传背景及作用机制等已经研究比较透彻；基因序列短，编码的蛋白质相对分子质量小；存在大量功能获得性和缺失性突变，可以为实验需求提供需要的梯度机械敏感性。 2瞬时受体电位通道及其在超声遗传学中的研究进展TRP离子通道是一类位于细胞膜上的阳离子通道超家族，从低等生物秀丽隐杆线虫到人类广泛存在。 TRP离子通道参与机体对外界机械刺激(如压力、声波等)作出响应的过程，与痛觉、触觉和听觉等感觉的产生有关。 根据氨基酸序列和三维结构不同，TRP离子通道可分成7个亚型TRPC(TRPcanonical)、TRPV(TRPvanilloid)、TRPM(TRPmelastatin)、TRPA(TRP-ankyrin)、TRPP(TRP-polycystin)、TRPML(TRP-mucolipin)及TRPN(TRPNompC)“岳17。 ，其中能对机械刺激产生响应的通道有TRPC(TRPCI、TRPC5和TRPC6)，TRPV(TRPVl、TRPV 2、TRPV 4、OSM 9、OCR 2、NAN和IAV)，TRPM(TRPM 4、TRPM7)，TRPA(TRPAl)，TRPP(TRPP2PKD2)和TRPN(TRPNl、TRP 4、NOMPC)lls1970TRPN亚型有三个成员，即NompC、TRPNl和TRP4。 Walker等陀01最先在果蝇中鉴别出TRPN亚型的NompC基因，深入研究后发现NompC离子通道在果蝇机械刺激传导过程中起着关键作用。 TRPNl是特异性存在于斑马鱼听觉毛细胞中的TRPN亚族成员，Sidi等。 21。 利用Morpholino抑制TRPN1的功能，导致斑马鱼听觉和平衡能力丧失。 TRP4通道在秀丽隐杆线虫特定神经元细胞的表达包括4个CEP多巴胺能神经元(CEPDL、CEPDR、CEPVL和CEPVR)、2个ADE多巴胺能神经元(ADEL和ADER)以及DVA和DVC中间神经元。 Li等22】发现巾4基因突变体线虫在运动过程中表现身体异常弯曲，说明TRP4离子通道在线虫中作为一个牵张感受器介导其本体感觉。 研究发现，TRP4离子通道能响应低强度超声而开放，改变线虫的行为。 Ibsen等81发现线虫TRP4缺陷突变体能减少线虫对机械刺激的响应，与野生型相比，超声波刺激(04l和047MPa)弓I起线虫突变体的反向运动行为数量减少，表明TRP4可能在超声波(负压峰值 将trp一4基因转到线虫AWC$*经元中表达，超声波刺激下进行钙成像分析发现，钙离子在AWC神经元中持续积累，而在野生型AWC细胞中并未发现该现象。 他们发现，PVD神经元的活性与线虫的行为有密切关系。 超声波刺激使trp一4基因表达的PVD神经元被激活，导致线虫减少倒转运动。 AIY中间神经元抑制线虫转向和n弯曲行为。 2?，促进其前移行为乜43；而trp4表达的AIY中间神经元线虫在超声刺激下，AIY可以促进Q弯曲行为，可能是TRP4通道的作用替代了AIY原有功能。 3双孔钾通道及其在超声遗传学中的研究进展K2P最早发现于人类肾脏中，Lesage等幢5通过表达序列标记方法发现结构不同于其他钾通道家族的弱内向整流钾通道1(tandem ofporedomains inaweek inwardrectifier K+channel1，TWIK1)。 与此通道进行序列同源性比对，研究人员在动物中枢神经系统、血管、肾脏及内分泌腺等器官和植物中相继找到K2P家族的其他离子通道成员i26；。 K2P是一个二聚体结构，每个亚基包含4个跨膜结构域(M1一M4)和2个孔道结构域(P1和P2)，胞外具有2个环状结构(Cl和c2)，其氨基端与羧基端均位于细胞质侧。 根据氨基酸序列及功能，K2P可分为6类，即TWIK、TWIK相关的双孔钾通万方数据洪非凡，等超声遗传学技术中的机械敏感性离子通道37道(TWIKrelated K+channel，TREK)、TWIK相关的酸敏感性双孔钾通道、TWIK相关的碱敏感性双孔钾通道、氟烷抑制的双孔钾通道和TWIK相关的脊髓双孑L钾通道险627。 Kubanek等乜81在非洲爪蟾蜍卵母细胞中表达K2P家族的TREK 1、TREK 2、TRAAK三个通道，通过电生理试验检测细胞对超声的刺激，研究发现FUS(10MHz，0349Wcm2)刺激后膜电流平均增加23，而添加K2P通道阻断剂氯化钡后超声刺激并没有引起膜电位变化，说明聚焦式超声波可以调节K2P离子通道活性，影响膜电位，从而改变细胞活性。 4Piezo离子通道及其在超声遗传学中的研究进展Piezo离子通道是由Coste等乜引发现并命名的一类通道家族，研究人员利用基因表达谱和RNA干扰候选基因表达的技术鉴定出Neur02A细胞系中产生机械敏感性电位所必需的Piezol(Fam38A)离子通道。 Piezo家族目前仅发现Piezol(Fam38A)和Piez02(Fam38B)两个成员，均在脊椎动物的细胞中被发现，但其同源分子也存在于非脊椎动物、植物和原生动物中。 Piezo蛋白的分子很大，相对分子质量约为12106，每个亚基由超过2000个氨基酸残基构成。 Ge等b们利用分辨率达048nm的冷冻电镜技术分析小鼠Piezol(共2547个氨基酸残基)结构，结果显示Piezo l是三联螺旋状结构，其胞外结构包括3个末端blade和1个中心帽子结构；羧基端构成离子通道的孔道部分，氨基端接受机械刺激而使羧基端的孔道开放。 Piezo蛋白感受机械刺激的作用机制等尚不明确，其巨大的分子结构除受机械刺激而开放之外，可能还有其他作用。 Syeda等口通过钙离子成像技术鉴定出一种可以特异性激活Piezol通道的小分子有机物Todal，表明Piezo蛋白可以作为一个化学门控离子通道发挥作用。 最近Pan等323在HEK293T细胞中表达Piezol离子通道，在微泡介导下超声刺激后细胞表现出相应的应激反应。 超声激活Piezol离子通道，随后钙离子进入细胞触发下游途径，包括磷酸酶活化，活化T细胞核因子(NFAT)去磷酸化并转移到细胞核，与上游转录元件结合从而启动基因表达。 再将Piezol基因转入JurkatT细胞系和初级T细胞系，形成嵌合抗原受体，转录激活后超声波刺激通道的开放以达到识别并根治目标肿瘤细胞的作用。 这种方法具有时空上的可控性及精准度，在癌症治疗中具有极大的前景，也可以为神经调节提供参考。 5展望超声遗传学技术在神经调控等方面具有自身优势，如非侵入性、体外调控方便、颅内多点聚焦、时空上的可控性和精确性。 但这项技术目前尚处于起步阶段，在实际操作应用前还有很多问题亟待解决如需要对离子通道的作用机制等更加透彻地研究，筛选能够精确控制的机械敏感性离子通道或其突变体；目前超声遗传学研究的对象多集中于体外培养的原代细胞和线虫、果蝇等低等生物，在小鼠等哺乳动物中的报道较少。 在很多报道中，超声波的传播和扩大都需要微泡参与口1432。 ，这也限制了其在高等生物中的应用。 此外，超声遗传学技术若要应用于临床治疗，需要将机械敏感性离子通道基因通过病毒表达在人脑内，这可能产生不良反应，在确定绝对安全之前必将存在极大的问题和争议。 超声遗传学技术对超声仪器也提出了更高的要求，如控制超声刺激中的热效应、空化效应和电容效应，提高超声聚焦的分辨率和超声调控的精确性，完善可佩戴式超声设备等。 超声遗传学技术成熟之后，其应用将不局限于神经科学研究领域。 超声刺激机械敏感性离子通道开放，引起细胞内外进行离子或者小分子物质的交换，启动细胞内信号通路，改变细胞的生理活动，导致细胞增殖、分化或凋亡等，在干细胞、免疫学、肿瘤治疗等生物医学领域均可广泛应用。 参考文献1BOYDEN ES，ZHANG F，BAMBERG E，et a1Millisecond-timescale，geically targetedopticaleontr01ofneuralactivity lJjNat Neurosci，xx，8 (9)1263126812j FRYF J，ADES HW，FRY W JProduction ofreversiblechanges inthe centralnervous systembyultrasoundJScience，1958，127 (3289)83-843FOSTER KR，WIEDERHOLD MLAuditoryresponses incats producedby pulsedultrasoundJJAcoustSoc Am，1978，63 (4)1199120514j TYLERWJ，TUFAIL Y，FINSTERWALD M，et a1Remote excitationof neuronalcircuits usinglow万方数据38浙江大学学报(医学版)Journal ofZhejiang University(Medical Sciences)intensity，lowfrequency ultrasoundJOLPLoS0ne，xx，3 (10)e35115DEFFIEUX T，YOUNAN Y，WATHEZ N，et a1Lowintensityfocused 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