碱性磷酸酶的分离纯化鉴定

分离纯化的一般程序 选择材料 破碎细胞 提取 分离纯化 分析及鉴定 AKP溶于30 乙醇 33 丙酮 上清中 AKP不溶于60 乙醇 50 丙酮 沉淀中 原理 操作 一 取材及匀浆取兔肝2g 剪碎 加入6ml0 01mol L醋酸镁和醋酸钠混合液 充分匀浆 记录体积 取0 1ml至一新EP管留作A液 测定时稀释25倍 二 提取加入2ml正丁醇 搅拌2min 室温放置30min 过滤 留上清 计体积 三 分离纯化1 50 丙酮沉淀AKP加入等体积丙酮 3000rpm 5min 留沉淀 加4ml0 5mol L醋酸镁溶解沉淀 记录体积 取0 1ml留作B液 稀释10倍 2 30 乙醇溶解AKP每ml溶液中加入95 乙醇0 46ml2000rpm 5min 留上清 记录体积 3 60 乙醇沉淀AKP每ml溶液中加入95 乙醇0 86ml3000rpm 5min 留沉淀 加3ml0 5mol L醋酸镁溶解沉淀 记录体积 取0 1ml留作C液 使用时稀释5倍 4 33 丙酮溶解AKP每ml溶液中加入0 33ml丙酮2000rpm 5min 留上清 记录体积 5 50 丙酮沉淀AKP每ml溶液中加入0 36ml丙酮3000rpm 15min 留沉淀 5mlPh8 8的Tris 醋酸镁溶解沉淀 D液 不稀释 四 分析及鉴定1 碱性磷酸酶的活性测定 磷酸苯二钠法 2 碱性磷酸酶蛋白含量测定 BCA法 3 比活性及纯化倍数计算 分光光度法 Spectrophotometry 根据物质对不同波长的光线具有选择性吸收 即可产生吸收光谱 的特性而建立起来的一种定量 定性分析的技术 也称为吸收光谱法 Absorptionspectrometry 不需要把欲分析的样品从混合物中分离开来 一 基本原理 光具有波粒二相性 波长和频率是光的波动性的特征 1 光的基本知识 紫外分光光度计 200 400nm 可见光分光光度计 400 760nm 红外分光光度计 760 1000nm 2 定量分析的理论基础 Lambert Beer定律 A K L C 吸光度 Aabsorbance A 消光度 degreeofextinction E 光密度 opticaldensity D K 吸光系数 是物质的特征性常数 对比法进行定量分析 A样 K L C样 A标 K L C标 A样 A标 K L C样 K L C标 C样 C标 C样 A样 C标 A标 单色光 平行光 max 溶液均匀 清澈 无散射溶液性质稳定 比色皿中无化学反应适用于稀溶液 A0 2 0 7 Lambert Beer定律的适用范围 溶剂空白 当显色剂及所用其它试剂在测定波长都没有吸收峰时 可用纯溶剂 如蒸馏水 作参比溶液 试剂空白 当显色前的样品在测定波长没有吸收峰 而显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收时 可用不加入样品的 试剂空白 作参比溶液 这种方式最为常用 参比溶液的选择 基本组件及常见分光光度计 分光光度计的使用 1 打开电源预热15分钟2 选择波长 max 3 光标指向Trans4 打开光门 调节0 关上光门调节100 5 重复4一次6 将光标指向ABS7 读数 磷酸苯二钠 碱性磷酸酶 苯酚 磷酸盐 碱性 苯酚 4 氨基安替吡啉 铁氰化钾 红色醌式化合物 AKP活性测定基本原理 磷酸苯二钠法 37保温15分钟各管加入铁氰化钾液2ml 静置15min 510nm比色 酚标准液浓度 稀释倍数 PH8 8tris醋酸镁溶液 251051 蛋白含量测定基本原理 BCA法 二喹啉甲酸 B