细胞工程选自课件.doc

什么是干细胞？胚胎干细胞如何建系？多利羊是如何诞生的？怎样利用转基因技术制备乳腺生物反应器？动物染色体改造的方法有哪些？体细胞中的一组非同源染色体，它们在形态和功能上各不相同，但携带着控制一种生物生长发育、遗传和变异的全部信息，这样的一组染色体，叫做一个染色体组。 染色体组型是指一个体细胞中全部染色体的数目、大小和形态特征。 染色体倍性是指细胞中包含的染色体组数或基数染色体工程 按照人们需要对生物体的染色体进行操作，添加、消减或替换染色体，从而达到定向选育新品种或创造人工新物种的目的。是染色体水平上的细胞工程。 广义上讲它还包括染色体内部的部分遗传操作技术。染色体工程建立在细胞遗传学研究的基础之上，利用已在染色体上标记的基因，应用染色体组合并、单条染色体或染色体片段的附加、代换、消除和易位等技术，按照一定的设计，有计划、有目的地实施对生物染色体组型或染色体结构进行改造，达到最终目的。 整倍变化：多倍体：细胞中含有三个或更多染色体组的个体单倍体：细胞中含有正常体细胞的一半染色体数 非整倍体变化：染色体减少：单体（减1条）、缺体（减1对）染色体增加：三体（加1条）、四体（加1对）染色体代换：同种代换、异种代换l 体细胞内以染色体组为基数进行的整倍性变化，以整倍体染色体数目变化产生的变异会产生多倍体和单倍体；l 染色体组内的个别染色体数目有所增减，使细胞内的染色体数目不是基数的的完整倍数，因此被称为非整倍体。n 染色体结构变异l 染色体易位：一个染色体上某一区段与另一非同源染色体上的区段发生互换。l 染色体缺失：染色体的某一区段及其带有的基因一起丢失。l 染色体倒位：染色体上某一区段连同它带有的基因顺序发生180度倒转。l 染色体重复：一个染色体上增加了相同的某个区段。l 动物染色体倍性改造是指有目的、有计划地增加或减少一组或几组同源或异源染色体，以创造动物新品种的一项染色体工程技术。l 主要包括多倍体育种和单倍体育种。（一） 染色体加倍的方法u 染色体加倍技术是染色体倍性改造的关键技术，分为自然加倍和人工诱导加倍两种。 人工诱导加倍方法主要包括：生物学方法、化学方法、物理学方法。 物理学方法包括：温度休克法、水静压法和高盐高碱方法。 化学诱导法是利用秋水仙素和细胞松弛素B等化学物质通过抑制细胞分裂而获得同源多倍体 生物学方法主要通过动物杂交的方法获得异源多倍体。其中杂交主要是种间或不同种属、科间的远缘杂交，使得染色体加倍，也成为染色体组的合并技术。骡子就是利用这种技术生产的极有价值的生物。化学诱导方法是最常用的方法之一。使用化学药剂主要有：秋水仙素、细胞松弛素B、麻醉剂N2O等 原理：秋水仙素在一定浓度范围内对细胞染色体复制没有什么破坏作用，但是能够抑制和破坏纺锤丝的形成，处理正在分裂的细胞后，使得染色体正在复制而细胞不发生分裂，从而形成同源多倍体的细胞，处理消除后，细胞可以恢复继续分裂。多用于植物诱导，动物中容易产生嵌合体，成活率低，使用较少，只在于种间杂交相结合时使用。 细胞松弛素B是常用的动物多倍体诱导剂，通过抑制肌动蛋白聚合成微丝，阻止细胞质的分裂。在多种贝类，大西洋蛙、中华绒鳌蟹中利用。u 物理学方法包括：温度休克法、水静压法和高盐高碱方法。其中前两种较常用，而且方法较好。 温度休克法包括略低于致死温度的冷休克方法（0-5）和略高于致死温度的热休克法（30 ） 两种。原理：温度休克法诱导多倍体关键是能否成功阻止第二次成熟分裂或第二极体的排出。三个制约因素：温度处理开始时间（TA）、处理持续时间（D）、处理温度（T）。冷水性鱼类（鲑科）用热休克法，而温水性鱼类用冷休克法效果好。 多倍体动物多具有良好的生长率和良好的生存力。 生产上利用三倍体不育的特性，将个体生殖腺发育消耗的能量用于动物生长上，同时可以很好的抑制产卵期鱼类（香鱼）的死亡和肉质变差问题，不仅可以避免繁殖季节肉质下降而延误上市时间或影响商品价值，同时也避免了生长停止和死亡率的增高，缩短了养殖周期，减少了养殖成本，可以养成大型个体。如：美国用来提高鲍鱼产量，日本培育的三倍体牙鲆。还可以培育出不育群体，以控制养殖密度，在昆虫方面有应用。四倍体可育，与二倍体杂交后获得不育的三倍体（全三倍体）很适合于水产养殖。转基因动物制备的原理是什么？2.如何培育绿色荧光小鼠？需要哪些关键技术？3.转基因动物制备的方法有哪些？各有哪些优、缺点？4.如何构建动物生物反应器5.转基因动物的前景如何？ 转基因技术将外源DNA导入细胞的一种技术。它是在DNA重组技术的基础上发展起来的。 转基因动物(Transgenic animal)指借助基因工程技术将外源基因（人们需要的目的基因）导入受体动物染色体内，外源基因与动物基因整合后随细胞分裂而扩增，在体内表达并能稳定遗传给后代的动物。四 制备转基因动物的一般程序 获取外源目的基因 外源目的基因导入细胞（生殖细胞或胚胎干细胞） 选择携带目的基因的细胞，选择体外培养系统和宿主动物 转基因胚胎的发育及鉴定 筛选所得的转基因动物转基因动物的关键技术 外源目的基因的制备 外源目的基因的有效导入 胚胎培养与移植 外源目的基因的检测六 制备转基因动物的方法 显微注射法 病毒载体法 胚胎干细胞介导法 生殖细胞介导法 YAC介导法 细胞核移植法优点： 可靠性高、重复性好，方法相对简单，导入过程直观； 对于小鼠来说，产生转基因动物的效率比较高； 导入DNA片段的大小和类型不受限制； 转基因在代与代之间传递的稳定性好。缺点： 整合位点的随意性可能对转基因表达造成影响； 可能会出现不希望的插入突变；开发装置和技术的花费大、时间长。（二）病毒载体法（retrovirus mediate gene transfer）细菌质粒和噬菌体载体只能将目的基因运载至细菌中扩增和表达。因此，动物病毒载体是较理想的真核基因工程载体。病毒DNA序列中有很强的启动子，可使其后方的外源基因高产量和高频率地表达。常用的有杆状病毒载体、SV40载体、痘苗病毒载体、逆转录病毒载体等。技术要点 逆转录病毒载体的构建 包装细胞 重组逆转录病毒感染早期胚胎优点：u 逆转录病毒可直接感染胚胎，把外源DNA引入细胞，且转移效率很高。u 逆转录病毒载体DNA没有合成病毒蛋白的能力，所以被转化的宿主细胞不会再产生有害的病毒颗粒，在安全的情况下，能够合成目的基因的产物。u 利用逆转录病毒作为目的基因载体，通过感染早期胚胎细胞实现基因的转移，产生嵌合体动物，在经过杂交、筛选即可获得转基因动物。 （三）胚胎干细胞介导法u 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）是从胚泡内细胞团分离得到的多潜能细胞。将外源基因导入体外培养的ES细胞，经筛选后获得整合稳定和表现良好的细胞，将这些细胞注射到胚泡腔中，部分ES细胞可与内细胞团融合并参与其分化，形成嵌合体。在嵌合过程中，带有外源基因的ES细胞可能进入生殖系，再经杂交育种得到纯合体，这种纯合体即为所需的转基因动物。 此方法在小鼠上应用比较成熟，大家畜比较困难。（五）YAC介导法u 技术途径u ES细胞转染YAC后，体外筛选阳性ES细胞并进行注射；u YAC原核注射。u 优点u 具有克隆百万碱基对的大片段外源DNA的能力，且保证巨大基因的完整性；u 整合效率提高；u 保证了顺式元件的完整性与结构基因的位置关系不变；u 可以消除基因整合后的“位置效应”。u 生物反应器的发展阶段细菌基因工程、细胞基因工程、转基因动物生物反应器。u 生物反应器选择的器官和组织为方便产物的获取，产生了动物乳腺反应器，动物血液生物反应器和动物膀胱生物反应器。u 乳腺生物反应器（mammary gland bioreactor)利用哺乳动物乳腺特异性表达的启动子元件构建转基因动物，指导外源基因在乳腺中表达，并从转基因动物的乳液中获取重组蛋白。 表达载体的构建 目的基因的选择 体外重组 基因的转移 制备转基因动物鉴定 产品质量稳定 产品成本低 研制开发周期短 无污染 经济效益显著乳腺生物反应器应用 改良乳汁品质 生产药用蛋白 1.什么是转基因动物 2.转基因动物培育的基本原理及一般程序 3.转基因动物制备的关键技术 4.制备转基因动物的主要方法及优缺点 5.转基因动物的应用及面临的问题 6.乳腺生物反应器的制备 7.乳腺生物反应器的应用一 多利羊的培育过程二 核移植的概念、分类和原理三 核移植技术的操作程序一 多利是如何诞生的？二 什么是核移植？有哪些种类？三 核移植技术包括哪些步骤？干细胞: 干细胞是一种具有自我更新和分化潜能的细胞。u 胚胎干细胞（embryonic stem cell,ES细胞）：指从着床前的内细胞团或原始生殖细胞获得的一种具有多潜能性、可发育成为各种细胞、同时可保持不分化状态而持续生长的克隆细胞系。u 成体干细胞(adult stem cell)：在成体组织内具有自我更新能力及能分化成一种或一种以上子细胞的未成熟细胞。 全能性干细胞（totipotent stem cell） 具有形成完整个体的分化潜能。如：胚胎干细胞。 多能性干细胞（multipotent stem cell） 具有分化出多种细胞组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。如：骨髓多能造血干细胞可分化出至少12种血细胞。 单能干细胞（committed stem cell） 是一种定向干细胞，又称专能干细胞、偏能干细胞，只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化。 胚胎干细胞的发育等级较高，是全能干细胞，而成体干细胞的发育等级较低，属多能或单能干细胞。其中，胚胎干细胞包括ES细胞、EC细胞和EG细胞，成体干细胞种类较多。胚胎干细胞和成体干细胞的区别胚胎干细胞 成体干细胞 来源 早期胚胎 胎儿或成体 细胞增殖能力 无限 有限 分化潜能 全能 有限 免疫排斥性 有排斥性 自体移植无排斥性 生物学功能 能分化成具有生理功能的细胞 能分化成具有生理功能的细胞伦理问题 存在 不存在 转分化(transdifferentiation) 一种组织类型的干细胞在适当条件下可以分化为另一种组织类型的细胞。 去分化(dedifferentiation) 一种干细胞向其前体细胞的逆向转化。四 ES细胞的建系 分离材料的获取及处理 早期胚胎的获取及处理方法 原生殖细胞的获取 分化抑制 分化抑制物质的选择 饲养层、条件培养基和分化抑制因子 基础培养基的选择 添加物质的选用 培养后分离传代 干细胞的定义、特点和分类 胚胎干细胞的建系 ES与成体干细胞的区别 组织工程的定义和应用 什么是ES？分为哪些种类？有什么特点？ ES和成体干细胞有什么区别？ ES的建系包括哪些步骤？ 什么是组织工程？有哪些应用？ 简述超数排卵的基本方法及其意义。 比较几种胚胎保存技术的优缺点。 简述胚胎移植的主要操作过程(以牛为例)。 简述X、Y精子常用的分离方法及其原理。 性别控制在生产实践中有何意义？性别控制的意义 1.在临床上通过性别控制可以避免一些与性别相关疾病的发生。 2.在畜牧业生产中通过性别控制生产所需要的后代，可以提高畜牧业生产的经济效益。 3.在动物育种过程中通过性别控制可以加快育种进程。 为了一次获得多个卵，利用促性腺激素处理，使得卵巢中有更多的卵泡发育，更多的卵被排出，这个过程就称为超数排卵（superovulation） 1. 细胞融合的方