DNA复制、损伤与修复

Replicationanddamagerepair 第二章DNA的复制 损伤和修复 第一节DNA的复制 Replication DNAbiosynthesis 指DNA双链在细胞分裂以前进行的复制过程 哺乳动物的细胞周期 一 半保留复制DNA在复制时 以亲代DNA的每一股作模板 合成完全相同的两个双链子代DNA 每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链 这种现象称为DNA的半保留复制 semi conservativereplication 意义 半保留复制说明DNA在代谢上的稳定性 经过许多代的复制 DNA链仍可保持完整 这在生物的遗传上是十分重要的 一 DNA复制特征 DNA以半保留方式进行复制 是在1958年由M Meselson和F Stahl所完成的实验所证明 该实验首先将大肠杆菌在含15N的培养基中培养约十五代 使其DNA中的碱基氮均转变为15N 将大肠杆菌移至只含14N的培养基中同步培养一代 二代 三代 分别提取DNA 作CsCl密度梯度离心 半保留复制证据 以原核生物大肠杆菌为例 原料 dNTP Mg 双链DNA模板引物 primer 常是RNA 有游离的3 OH 引物酶 primase DnaG 用于合成复制所必需的RNA引物解螺旋酶 helicase DnaB 由DnaA和DnaC协助在复制的起始点 OriC 上解开双螺旋 与复制有关的酶和因子 复制的起始点与方向 亲代DNA开链 复制起始点呈叉型移动 复制起始点 ori DNA复制要从DNA分子的特定部位开始 此部位称复制起始点原核 一个起始点 约245bp 特殊的重复序列真核 多个起始点 ori E coli复制起始点oriC跨度为245bp 包括两个关键序列 13bp的序列和9bp序列 它是决定和控制E coli染色体复制的唯一片段 13bp序列区 每一个顺序都由GATC开始 富含A和T 有助于螺旋解开 控制复制何时开始 9bp重复序列 重复出现4次 能与起始蛋白dnaA特异结合 当dnaA蛋白 约20种 结合于ori的4个部位上时复制开始 dnaA蛋白 一种专一的蛋白 和ori结合后 双螺旋解开形成复制叉 故dnaA蛋白与启动解链有关 dnaA蛋白是起始的关键成分 大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列 基因组能独立进行复制的功能单位称为复制子 replicon 每个复制子都含有控制复制起始的起点 origin 可能还有终止复制的终点 terminus 每个起始点产生两个移动方向相反的复制叉 复制完成时 复制叉相遇并汇合连接 习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子 二 复制子 一个复制子只含有一个专一的复制起点和复制结束的终点 一个完整的复制子在一个细胞周期只复制一次 真核 原核生物染色体和质粒都是独立 只有单一个 复制子 真核细胞染色体中有多个复制子组成 DNA复制时 以复制起始点为中心 向两个方向进行复制 但在低等生物中 也可进行单向复制 如滚环复制 原核细胞 染色体和质粒固定起点双向复制 真核生物 染色体DNA 复制时多个起始点 三 复制方向 复制方向 DNA合成的方向单向 双向 1个起始点 复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图 Caims实验 将3H 胸苷标记大肠杆菌DNA 经过近两代的时间 3H 胸苷掺入大肠杆菌DNA 用溶菌酶把细胞壁消化掉 使完整的大肠杆菌染色体DNA释放出来 放射自显影 得到上图 非复制部分 C 银粒子密度较低 由一股放射性链和一股非放射性链构成 已复制部分站整个染色体的三分之二 其中一条双链 B 仅有一股链是标记的 另外一股双链 A 的两股链都是标记的 银粒子密度为前二者的两倍 染色体全长约为1100微米 双向复制 复制子 真核生物两个相邻复制起始点之间的DNA片段 以起始点为中心 向两个方向进行复制 多个起始点 二 DNA复制的酶学 1 模板 解开成单链的DNA母链 3 DNA聚合酶 DNA pol 2 底物dNTP dATP dGTP dCTP dTTP 4 引物 primer RNA引物 5 其他酶和蛋白质因子 解链相关酶类 1 解旋酶 helicase 2 拓扑异构酶 topoisomeraseI II 3 单链DNA结合蛋白 SSB DNA解旋酶 helicase 解链酶 功能 DNA的双螺旋解链 解DNA双链 解开一对碱基 需2分子ATP 作用点 DNA上局部单链处 向双链方向解链 种类 E coli有四种解螺旋酶 I II III和rep蛋白 I II III中任一种沿模板5 3 方向移动 rep蛋白沿模板3 5 方向移动 拓扑异构酶 Topo DNA正超螺旋与负超螺旋 负超螺旋 正超螺旋 DNA双螺旋 拓扑异构酶 首先在大肠杆菌中被发现 它可使DNA的一条链发生断裂和再连接 反应无需供给能量 另外 DNA复制时负超螺旋的消除 亦由拓扑异构酶 来完成 但它对正超螺旋无作用 型拓扑异构酶 由两个A亚基和两个B亚基组成 即A2B2 它能使DNA的两条链同时发生断裂和再连接 当它引入负超螺旋以消除复制叉前进带来的扭曲张力时 需要由ATP提供能量 两种拓扑异构酶在DNA复制 转录和重组中均发挥重要作用 型拓扑异构酶 拓扑异构酶I抑制剂 喜树碱类拓扑异构酶II抑制剂 依托泊苷 多柔比星 阿霉素类等 单链DNA结合蛋白 SSB 作用 防止单链DNA重新形成双链 防止单链DNA被核酸酶水解 SSB DNA聚合酶 DNA pol 即依赖于DNA的DNA聚合酶 DDDP 真核生物有多种 DNA pol 原核生物有3种 DNA pol DNA聚合酶功能 5 3 聚合作用5 3 外切酶3 5 外切酶活性 大肠杆菌三种DNA聚合酶比较 DNA聚合酶 分子量每个细胞的分子统计数5 3 聚合酶作用3 5 核酸外切酶作用5 3 核酸外切酶作用转化率主要功能活性 nt min DNA聚合酶 DNA聚合酶 复合物 109 000400 1校读 修复1000 120 00040 0 05 400 00010 20 50复制100000 特性 不清填补缺口50 引物酶 Primase 和引发体 催化RNA引物合成的酶叫引物酶 它是一种特殊的RNA聚合酶 DNA合成需在RNA引物的基础上进行 DnaA 引发体 primosome 包括解螺旋酶 DnaC 引物酶及DNA复制的起始区域 小结 主要成员 主要作用 DnaA识别复制起始位点 解螺旋酶解开DNA双链 SSB维持已解开单链DNA的稳定 引物酶合成RNA引物 TOPO使打结 缠绕 正超螺旋的DNA松驰 DNA pol DNA复制 DNA pol 水解引物 填补空隙 修复作用 DNA连接酶催化双链DNA中单链缺口的连接 三 复制的化学反应 生成磷酸二酯键 dN2TP PPi DNApol 3 TAGAAGACCTATTGGCC 5 5 ATCTTCTGGATAACCGG 3 第三节DNA生物合成过程 1 复制的起始 2 链的延长 3 复制的终止 一复制的起始 一 DNA解成单链 由特定蛋白质识别复制起始位点 ori 在解螺旋酶 TOPO酶及单链DNA结合蛋白的共同作用下 DNA解链 解旋 形成复制叉 倒Y 二 引发体的生成 解旋酶解开双链后引物酶进入形成引发体 三 RNA引物的合成 参与复制起始的蛋白因子 名称 功能 DnaA蛋白辨认起始点 解螺旋酶 DnaB Rep 解开DNA双链 DnaC协助解螺旋酶 引物酶 DnaG 催化RNA引物生成 SSB稳定解开的单链 拓扑异构酶理顺DNA链 OriCE coli复制起始点 领头链的合成 引物合成后 由DNApol 在真核细胞为DNA聚合酶 和 催化 按碱基配对原则 将dNTP逐一添加到引物3 末端 形成磷酸二酯键 使新合成的链不断延长 二复制的延长 3 AAGACCTATT 5 5 TTCTGGATAA 3 DNAPolI IIandIII 延长 冈崎片断 复制过程简图 半不连续复制 semi discontinuousreplication 领头链连续复制而随从链不连续复制 就是复制的半不连续性 领头链 leadingstrand 随从链 laggingstrand 随从链上不连续性片段的连接 三复制的终止 原核生物基因是环状DNA 双向复制的复制片段在复制的终止点 ter 处汇合 第四节 真核生物DNA生物合成 一 DNA的复制只发生在S期 二 多复制子 三 真核细胞含有5种DNA聚合酶 四 端粒复制染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物 去除后留下空隙 需要引物DNA聚合酶不能直接聚合游离的dNTP 必须由一段核酸片段提供3 OH末端作为引物 primer 才能开始聚合子代DNA链 RNA引物的大小 在原核生物中通常为50 100个核苷酸 而在真核生物中约为10个核苷酸 RNA引物的碱基顺序 与其模板DNA的碱基顺序相配对 双向复制DNA复制时 以复制起始点为中心 向两个方向进行复制 但在低等生物中 也可进行单向复制 如滚环复制 半不连续复制 semidiscontinuousreplication 由于DNA聚合酶只能以5 3 方向聚合子代DNA链 即模板DNA链的方向必须为3 5 因此 分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时的方式是不同的 定义 在DNA复制过程中 亲代DNA分子中以3 5 方向的母链作为模板指导新的链以5 3 方向连续合成 另一股以5 3 为方向的母链则指导新合成的链以5 3 方向合成1000 2000个核苷酸长度的许多不连续的片段 岗崎片段 这种复制方式称之为半不连续复制 PPP OH DNA合成方向不可能是3 5 的解释 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 前导链 随从链 岗崎片段 半不连续复制 以3 5 方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的 其子代链的聚合方向为5 3 这一条链被称为领头链 leadingstrand 而以5 3 方向的亲代DNA链为模板的子代链在复制时则是不连续的 其链的聚合方向也是5 3 这条链被称为随从链 laggingstrand 前导链 在引物的3 端按5 3 方向连续不断地合成的DNA链 随从链 在引物的3 端按5 3 方向不连续合成的DNA链 冈崎片段 随从链上不连续合成的DNA短片段 不包括引物 由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的 因此 随从链的合成是一段一段的 DNA在复制时 由随从链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段 Okazakifragment 冈崎片段的大小 在原核生物中约为1000 2000个核苷酸 而在真核生物中约为100个核苷酸 DNA聚合酶 DNApolymerase 聚合酶III 主要的复制酶 兼有校读 纠错的功能有从5 3 延伸多核苷酸链的聚合酶活性 有模板依赖性 其延伸的方式是依据碱基互补配对的原则 将原料dNTP与末端核苷酸游离的3 OH以3 5 磷酸二酯键连接 同时释出一个PPi DNA聚合酶延伸多核苷酸链的方向总是5 3 有从3 5 外切酶的活性 以切除可能错配的核苷酸 聚合酶I用于切除引物RNA 并填补留下的空隙有从5 3 延伸多核苷酸链的聚合酶的活性 有从3 5 外切酶的活性 以切除可能错配的核苷酸 有从5 3 外切酶的活性 其作用是切除引物聚合酶II活性弱 作用与聚合酶III相似有从5 3 延伸多核苷酸链的聚合酶活性 有从3 5 外切酶的活性 323个氨基酸 小片段 5 核酸外切酶活性 大片段 Klenow片段 604个氨基酸 DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性 N端 C端 DNA pol Klenow片段是实验室合成DNA 进行分子生物学研究中常用的工具酶 DNA连接酶 ligase 将不连续的DNA片段以3 5 磷酸二酯键连接起来 原核生物通过分解NAD为NMN和Pi提供能量 真核生物则消耗ATP 复制的终止 由DNA聚合酶I完成切除引物 并且填补空隙 由DNA连接酶将DNA片段连接起来 真核生物端粒的形成端粒 telomere 是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分 通常膨大成粒状 其共同的结构特征是由一些富含G C的短重复序列构成可重复数十次至数百次 线性DNA在复制完成后 其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短 故需要在端粒酶 telomerase 的催化下 进行延长反应 端粒酶是一种RNA 蛋白质复合体 它可以其RNA为模板 通过逆转录过程对末端DNA链进行延长 1 端粒telemer 指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构 2 结构特点 1 由末端单链DNA序列和蛋白质构成 2 末端DNA序列是多次重复的富含G C碱基的短序列 端粒 telomere 染色体线性DNA分子末端通常膨大成粒状共同的结构特征 富含TG短重复序列维持染色体稳定端粒酶 telomerase RNA 蛋白质复合体逆转录酶延长末端DNA链进行 3 功能 1 维持染色体的稳定性 2 维持DNA复制的完整性4 端粒酶 由RNA和蛋白质组成 1 RNA发挥模板作用 2 蛋白质发挥逆转录酶活性 端粒酶的催化延长作用 爬行模型 DNA聚合酶复制子链 进一步加工 第五节 DNA的几种复制方式 1 直线双向复制单点双向 T7噬菌体多点双向 真核染色体DNA 2 型复制 环状双链DNA 对称复制 单向或双向 E coli 3 滚环复制 环状单链DNA x174 4 D环复制 取代环复制 不对称复制 线粒体 叶绿体DNA 两条链的复制起点不在同一点上 一条链先复制 另一条链保持单链而被取代 当一条链复制到一定程度时才暴露出另一条链的复制起点 另一条链才开始复制 线性DNA的复制 成环或多连体复制 如T4 噬菌体多连体复制 两个5 有空缺的分子通过3 凸出的重复序列互补 DNApolI从3 补齐这个空缺 连接酶连接裂缝 再用限制性内切酶产生3 凹端 polI便可填补空缺产生新链 末端二级结构 发夹结构或十字形交叉作为引物端粒复制蛋白质介导末端连接蛋白质提供3 OH 如 29 腺病毒3 端有 80KDa的特异性蛋白 TP 以Ser的OH基团形成磷酸二酯键 作为引物进行链取代方式复制 环状DNA的复制 复制滚环复制D 环复制 滚环复制和D环复制 滚环复制 rollingcirclereplication 是某些低等生物的复制形式 如 X174和M13噬菌体等 滚环复制的过程 D环复制 D loopreplication 是线粒体DNA mitochondrialDNA mtDNA 的复制形式 第六节DNA的损伤一 DNA的损伤 突变 由自发的或环境的因素引起DNA一级结构的任何异常的改变称为DNA的损伤 也称为突变 mutation 常见的DNA的损伤包括碱基脱落 碱基修饰 交联 链的断裂 重组等 一 引起突变的因素1 自发因素 1 自发脱碱基 由于N 糖苷键的自发断裂 引起嘌呤或嘧啶碱基的脱落 每日可达近万个核苷酸残基 2 自发脱氨基 胞嘧啶自发脱氨基可生成尿嘧啶 腺嘌呤自发脱氨基可生成次黄嘌呤 每日可达几十到几百个核苷酸残基 3 复制错配 由于复制时碱基配对错误引起的损伤 发生频率较低 2 物理因素由紫外线 电离辐射 X射线等引起的DNA损伤 其中 X射线和电离辐射常常引起DNA链的断裂 而紫外线常常引起嘧啶二聚体的形成 如TT TC CC等二聚体 这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的环丁烷结构 因而会引起复制障碍 3 化学因素 1 脱氨剂 如亚硝酸与亚硝酸盐 可加速C脱氨基生成U A脱氨基生成I 2 烷基化剂 这是一类带有活性烷基的化合物 可提供甲基或其他烷基 引起碱基或磷酸基的烷基化 甚至可引起邻近碱基的交联 3 DNA加合剂 如苯并芘 在体内代谢后生成四羟苯并芘 与嘌呤共价结合引起损伤 4 碱基类似物 如5 FU等 可掺入到DNA分子中引起损伤或突变 5 断链剂 如过氧化物 含巯基化合物等 可引起DNA链的断裂 二 DNA突变的类型碱基的转换 二 DNA损伤的修复DNA损伤的修复方式可分为直接修复和取代修复两大类 一 直接修复1 光复活 lightrepairing 这是一种广泛存在的修复作用 光复活能够修复任何嘧啶二聚体的损伤 其修复过程为 光复活酶 photo lyase 识别嘧啶二聚体并与之结合形成复合物 在300 600nm可见光照射下 酶获得能量 将嘧啶二聚体的丁酰环打开 使之完全修复 光复活酶从DNA上解离 2 转甲基作用在转甲基酶的催化下 将DNA上的被修饰的甲基去除 此时 转甲基酶自身被甲基化而失活 3 直接连接DNA断裂形成的缺口 可以在DNA连接酶的催化下 直接进行连接而封闭缺口 二 取代修复1 切除修复 excisionrepairing 这也是一种广泛存在的修复机制 可适用于多种DNA损伤的修复 该修复机制可以分别由两种不同的酶来发动 一种是核酸内切酶 另一种是DNA糖苷酶 可修复TT 电离辐射 某些化学诱变剂造成的DNA结构的破坏参加的酶有 特异的核酸内切酶 外切酶 聚合酶 连接酶 2 重组修复 recombinationrepairing 这是DNA的复制过程中所采用的一种有差错的修复方式 重组修复 复制后修复 3 SOS修复由DNA损伤或抑制复制的处理所引起的一系列复杂的诱导效应 称为应急反应 SOS 这是一种在DNA分子受到较大范围损伤并且使复制受到抑制时出现的修复机制 以SOS借喻细胞处于危急状态 DNA分子受到长片段高密度损伤 使DNA复制过程在损伤部位受到抑制 损伤诱导一种特异性较低的新的DNA聚合酶 以及重组酶等的产生 由这些特异性较低的酶继续催化损伤部位DNA的复制 复制完成后 保留许多错误的碱基 从而造成突变 DNA损伤与药物评价 1 遗传毒性试验遗传毒性研究在药物研发中处于比较的重要位置 遗传毒性试验能检出DNA损伤及其损伤的固定 以基因突变 较大范围染色体损伤 重组和染色体数目改变形式出现的DNA损伤的固定 一般被认为是可遗传效应的基础 并且是恶性肿瘤发展过程的环节之一 在检测这些类别损伤的试验中呈阳性的化合物为潜在人类致癌剂和 或致突变剂 由于在人体中已建立了某些化合物的暴露和致癌性之间的关系 而对于遗传性疾病尚难以证明有类似的关系 故遗传毒性试验主要用于致癌性预测 实验方法 Ames试验 污染物致突变性检测 是检测化学物质基因突变的常用方法 沙门氏菌回复突变试验 鼠伤寒沙门氏菌 Salmonellatyphimurium 的组氨酸营养缺陷型 his 菌株 在含微量组氨酸的培养基中 除极少数自发回复突变的细胞外 一般只能分裂几次 形成在显微镜下才能见到的微菌落 受诱变剂作用后 大量细胞发生回复突变 自行合成组氨酸 发育成肉眼可见的菌落 在评价突变危害中常用的有特殊重要意义的试验 TK基因突变试验 TK基因突变试验是一种哺乳动物体细胞基因正向突变试验 近年来其应用价值有明显的提高 TK基因突变试验的检测终点是胸苷激酶 thymidinekinase TK 基因的突变 在人类 TK基因定位于17号染色体长臂远端 在小鼠则定位于11号染色体 故TK基因的突变属于常染色体基因突变 TK基因的产物胸苷激酶在体内催化从脱氧胸苷 TdR 生成胸苷酸 TMP 的反应 在正常情况下 此反应并非生命所必需 原因是体内的TMP主要来自于脱氧尿嘧啶核苷酸 dUMP 即由胸苷酸合成酶催化的dUMP甲基化反应生成TMP 但如在细胞培养物中加入胸苷类似物 如三氟胸苷 即TFT trifluorothymidine 则TFT在胸苷激酶的催化下可生成三氟胸苷酸 进而掺入DNA 造成致死性突变 故细胞不能存活 若TK基因发生突变 导致胸苷激酶缺陷 则TFT不能磷酸化 亦不能掺入DNA 故细胞在含有TFT的培养基中能够生长 即表现出对TFT的抗性 根据突变集落形成数 计算突变频率 以判定受试物的致突变性 试验采用的靶细胞系主要有小鼠淋巴瘤细胞L5178Y以及人类淋巴母细胞TK6和WTK1等 其基因型均为tk TK基因突变试验可检出包括点突变 大的缺失 重组 染色体异倍性和其他较大范围基因组改变在内的多种遗传改变 转基因小鼠基因突变试验 转基因小鼠基因突变试验可在整体状态下检测基因突变 比较不同组织 包括生殖腺 的突变率 确定靶器官 对诱发的遗传改变作精确分析等 国外已陆续发展了多种用于突变检测的转基因动物 其中3种已投入商品化生产 MutaTM小鼠 Big BlueTM小鼠和Xenomouse小鼠 它们分别采用大肠杆菌乳糖操纵子的LacZ和 或Lacl作为诱变的靶基因 反向限制性酶切位点突变分析法 inverserestrictionsitemutation iRSM iRSM适用于快速检测诱变剂所致体内外DNA的突变 这些突变的特点是使某一酶切位点变为另一酶切位点 该方法建立者Jenkins等首先将iRSM应用于化学诱变剂所致动物体内p53基因的突变检测 小鼠分别口服N 乙基N 亚硝基脲 ENU 2 乙酰氨基芴 2 AAF 和二甲基酰肼 DMH 3天后 以iRSM方法相应地检测小鼠脾 骨髓和肝组织p53基因第6内含子区域的Apa Ava位点反向突变 结果表明ENU诱发肝组织p53基因突变的发生率为33 2 AAF使肝组织突变的发生率为25 这一阳性突变率反映出了不同诱变剂对相应组织的致突变强度 进一步验证了该方法的高灵敏度和