DNA重组技术基本工具

专题一基因工程 DNA重组技术的基本工具 本节知识内容 DNA聚合酶和DNA连接酶有何相同点和不同点 DNA连接酶 DNA聚合酶 连接DNA链 连接部位 双链 在两DNA片断之间形成磷酸二脂键 单链 将单个核苷酸加到已存在的核酸片断3 末端形成磷酸二脂键 连接黏性末端 连接黏性末端和平末端 分类 作用 E coliDNA连接酶 连接酶种类 T4DNA连接酶 核苷酸分子的连接 DNA聚合酶连接单链DNA把单个脱氧核苷酸连接到DNA片段上 T 磷酸二酯键 A G 限制酶切割磷酸二酯键 温故知新 1 什么是基因 2 基因与DNA 染色体的关系如何 3 基因存在于细胞的哪些结构中 4 基因重组有哪些类型 5 为什么人的基因可以与大肠杆菌的DNA拼接在一起 6 为什么人的基因可以在大肠杆菌细胞内表达 1 什么是基因 有遗传效应的DNA片段 2 基因与DNA 染色体的关系如何 基因是DNA的片段 在DNA分子上呈线性排列 染色体是基因的主要载体 3 基因存在于细胞的哪些结构中 细胞核 叶绿体 线粒体 4 基因重组有哪些类型 1 减数第一次分裂的前期 四分体的非姐妹染色单体间的交叉互换 2 减数第一次分裂后期 非同源染色体的自由组合 3 转基因操作实现的基因重组 5 为什么人的基因可以与大肠杆菌的DNA拼接在一起 不同生物的DNA具有相似的化学成分和基本结构 6 为什么人的基因可以在大肠杆菌细胞内表达 生物共用一套遗传密码 基因表达都遵循中心法则 定向改造生物的设想 能否让细菌 吐出 蚕丝 设想一 能否让微生物生产出人的胰岛素 干扰素 设想二 经过多年的努力 科学家于20世纪70年代创立了可以定向改造生物遗传性状的新技术 基因工程 乳汁中含有人生长激素的转基因牛 转生长激素基因鲤鱼 左 转基因抗虫棉 抗虫棉 普通棉 基因工程是指按照人们的意愿 进行严格的设计 并通过体外DNA重组和转基因等技术 赋予生物以新的遗传特性 从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品 由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的 因此又叫做DNA重组技术 一 基因工程的概念 体外DNA重组和转基因等技术 生物体外 基因 DNA分子水平 创造出更符合人类需要的新的生物类型和生物产品 剪切 拼接 导入 表达 原理 基因重组 基因拼接技术或DNA重组技术 生物体外 基因 DNA分子水平 人类需要的基因产物 剪切 拼接 导入 表达 基因重组 基因工程的概念 培育转基因抗虫棉的关键步骤有哪些 抗虫基因来自苏云金芽孢杆菌 基因工程的实例 关键步骤一 关键步骤二 关键步骤三 将抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来 抗虫基因与运载体DNA连接 将抗虫基因导入棉花细胞 并使其表达 解决这些关键步骤需要哪些基本工具 关键步骤一的工具 关键步骤二的工具 关键步骤三的工具 分子手术刀 限制性内切酶 分子缝合针 DNA连接酶 分子运输车 运载体 1 分子手术刀 限制性核酸内切酶 限制酶 二 基因工程的基本工具 1 主要来源 2 种类与命名 3 作用特点 4 作用结果 原核生物 少数真菌中也含有 2 种类与命名 现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内切酶 限制酶 EcoR Sma 粘质沙雷氏杆菌 Serratiamarcesens 大肠杆菌 EscherichiacoliR 练习 流感嗜血杆菌的d菌株 Haemophilusinfluenzaed 中先后分离到3种限制酶 则分别命名为 Hind Hind 和Hind 3 作用特点 识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列 切割每一条链中特定部位的两核苷酸之间的磷酸二酯键 5 端 3 端 磷酸二酯键 C G A 几种限制酶的识别序列和切割位点 想一想 各种限制酶的识别序列有什么特点 限制酶所识别的序列 无论是6个碱基还是4个碱基 都可以找到一条中轴线 中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向 对称排列的 4 限制酶的作用结果 产生黏性末端或平末端 限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开 使DNA片段末端的一条链多出几个核苷酸 与具有互补核苷酸的另一DNA片段末端可以黏合 这种DNA片段末端称为黏性末端 2 限制酶在它识别序列的中轴线处分别切开DNA的两条链 产生的DNA片段末端是平齐的 称为平末端 黏性末端 黏性末端 在对称中心的中心轴线两侧切开 大肠杆菌的一种限制酶EcoR 能识别GAATTC序列 并在G和A之间切开 Sma 平末端平末端 在对称中心的中心轴线处切开 寻根问底 你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗 原核生物易受自然界外源DNA的入侵 但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制 以防止外来病原体的侵害 限制酶就是细菌的一种防御工具 当外源DNA侵入时 限制酶会将外源DNA切割掉 以保证自身的安全 2 分子缝合针 DNA连接酶 1 作用 将双链DNA片段 缝合 起来 恢复被限制酶切开的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键 2 种类 E coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 E coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 来源 功能 大肠杆菌 T4噬菌体 恢复磷酸二酯键 只能连接黏性末端 能连接黏性末端和平末端 相同点 区别 将双链DNA片段 缝合 起来 恢复单链中两个相邻的脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键 E coliDNA连接酶或T4DNA连接酶 T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙 缝合 起来 但效率较低 寻根问底 DNA连接酶与DNA聚合酶的作用相同吗 以模板链为模板按照碱基配对原则 催化游离脱氧核苷酸的磷酸基团与上一个核苷酸的羟基形成磷酸二酯键 DNA聚合酶 dGTP 只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上 需要一条DNA链作模板 催化磷酸二酯键的形成 将DNA双链上的两个缺口同时连接起来 不需要模板 将单个脱氧核苷酸连接成DNA链的主要酶是 A DNA连接酶B DNA酶C DNA解旋酶D DNA聚合酶 3 基因进入受体细胞的 运输车 运载体 1 作用 2 种类 将外源基因导入受体细胞 质粒 噬菌体的衍生物和动植物病毒 运载体必须具备的条件 假如目的基因导入受体细胞后不能复制 将会怎样 作为载体没有限制酶的切割位点将会怎样 怎样检测目的基因是否导入受体细胞 如果载体对宿主细胞有害将会怎样 3 运载体的特点 必须具备的条件 能够在受体细胞中进行自我复制 或整合到染色体DNA上 随染色体DNA进行同步复制 有一个至多个限制酶切割位点 供外源基因插入 具有特殊的标记基因 供重组DNA的鉴定和选择 对受体细胞无害 大小合适 以便提取和操作 最常用的运载体是质粒 质粒是一种裸露的 结构简单 独立于细菌拟核之外 并具有自我复制能力的双链环状DNA分子 质粒的特点 1 细菌染色体 或拟核DNA 外能自主复制的小型环状DNA分子 2 质粒的存在对宿主细胞无影响 3 质粒的复制只能在宿主细胞内完成 在进行基因工程操作中 真正被用作载体的质粒 都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的 课后练习参考答案 2和7能连接形成 ACGT TGCA 4和8能连接形成 GAATTC CTTAAG 3和6能连接形成 GCGC CGCG 1和5能连接形成 CTGCAG GACGTC P71 2 基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的 它们各自可以识别和切断DNA上特定的碱基序列 细菌中限制酶之所以不切断自身DNA 是因为含有某种限制酶的细胞 其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列 或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上 使限制酶不能将其切开 3 作为基因工程使用的载体必需满足以下条件 1 有一个或多个限制酶的切割位点 以便目的基因插入 2 必须具备自我复制的能力 或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制 3 必须带有标记基因 以便重组后进行重组子的筛选 4 载体必须是安全的 不会对受体细胞有害 或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去 5 载体DNA分子大小应适合 以便提取和在体外进行操作 天然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件 都要进行人工改造后才能用于基因工程操作 1 以下说法正确的是 A 所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B 质粒是基因工程中唯一的运载体C 运载体必须具备的条件之一是 具有多个限制酶切点 以便与外源基因连接D DNA连接酶使黏性末段的碱基之间形成氢键 C 练习 2 有关基因工程的叙述正确的是 A 限制酶只在获得目的基因时才使用B 重组质粒的形成在细胞内完成C 质粒都可作为运载体D 蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料 D 3 已知标记基因有抗四环素基因和抗青霉素基因 现欲探讨某细菌的质粒中有无标记基因或标记基因是什么 请设计实验 预期实验结果 并得出相应的实验结论 实验原理 作为运载体的质粒 须有标记基因 这一标记基因是抗菌素抗性基因 有抗菌素抗性的细菌 其质粒才可用作运载体 材料用具 青霉素 四环素的10万单位溶液 菌种试管 灭菌的含细菌培养基的培养皿 酒精灯 接种环 一次性注射器 蒸馏水 恒温箱 方法步骤 第一步 取四个含细菌培养基的培养皿并标为1 2 3 4号 在酒精灯旁 用四支注射器 分别注入1mL蒸馏水 青霉素液 四环素液 青霉素和四环素的混合液 并使之分布在整个培养基表面 第二步 将接种环在酒精灯上灼烧 冷却后在酒精灯火焰旁挑取菌种 对四个培养皿分别接种 第三步 将接种后的四个培养皿放入37 恒温箱培养24h 观察有无菌落生长 预期结果及结论 预期实验结果和实验结论 1号培养皿中有细菌菌落 2 3 4号培养皿中 仅2号出现细菌菌落 说明该质粒有青霉素抗性基因 而没有四环素抗性基因 2 3 4号培养皿中 仅3号出现细菌菌落 说明该质粒有四环素抗性基因 而没有青霉素抗性基因 2 3 4号培养皿中都有出现细菌菌落 说明该质粒有两种抗菌素的抗性基因 2 3 4号培养皿中均无细菌菌落 说明该质粒没有这两种抗菌素的抗性基因 内含子和外显子 原核生物的基因是编码蛋白质的一个完整的DNA片段 真核生物的大多数为蛋白质编码的基因都含有 间隔序列 即不为蛋白质编码 转录产物不在成熟mRNA中出现的片段 真核生物基因中不编码蛋白质的间隔序列称为内含子 而编码的片段则称为外显子 非编码区 非编码区 编码区 RNA聚合酶结合位点 外显子 内含子 终止子 基因的结构 启动子 原核生物 真核生物 原核细胞与真核细胞的基因结构比较 连续 不连续 编码区 非编码区 3 有关基因工程的叙述中 错误的是 A 基因工程技术能定向地改造生物的遗传性状 培育生物新品种B 重组DNA的形成在细胞内完成C 目的基因须由运载体导入受体细胞D 质粒都可作为运载体 BD 4 关于限制酶说法中 正确的是 A 限制酶是一种酶 只识别GAATTC碱基序列B EcoRI切割的是G A之间的氢键C 限制酶一般不切割自身的DNA分子 只切割外源DNAD 限制酶只存在于原核生物中 C 5 有关基因工程的叙述中 错误的是 A DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来B 限制性内切酶用于目的基因的获得C 目的基因须由运载体导入受体细胞D 人工合成目的基因不用限制性内切酶 A 6 不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A 能复制B 有多个限制酶切点C 具有标记基因D 它是环状DNA D 7 下列哪项叙述不是运载体必须具备的条件 A 具有某些标记基因B 决定宿主细胞的生存C 能够在宿主细胞中复制D 有多个限制酶切点 B 8 以下有关基因工程的叙述 正确的是 A 基