FACS 胞内染色.doc

流式胞内染色实验方法方案A：两步法胞内（细胞质）蛋白染色。方案B：一步法胞内蛋白染色（细胞核）。注意：1、不同细胞因子的刺激条件是不同的，比如：LPS刺激活化单核细胞分泌IL-6的培养时间一般是6个小时，而检测IL-10则需要刺激24小时。2、结合荧光的流式抗体应在4度，避光储存。3、使用抗体前请低速离心30秒，使贴壁抗体沉底。不建议斡旋混匀抗体，可用手指轻弹混匀。4、除非方案中注明，默认的抗体孵育方法是冰上或4度避光。5、缓冲液中加BSA或FBS可以减少固定破膜后的非特异性背景。方案A:两步法胞内（细胞质）蛋白染色实验材料：1275mm 圆底检测流式管。可选可固定的活度染料eFluor 450 (eBioscience Cat. No. 65-0863), eFluor 660 (eBioscience Cat. No. 65-0864)，eFluor 780 (eBioscience Cat. No. 65-0865)。胞内抗原的直标抗体。IC Fixation Buffer (eBioscience Cat. No. 00-8222)。Permeabilization Buffer (10X) (eBioscience Cat. No. 00-8333)双蒸水稀释成1。Flow Cytometry Staining Buffer (eBioscience Cat. No. 00-4222)（可以自己配置）。实验流程：1、按照流式样品要求制备单细胞悬液。2、按照流式表面染色方法标记CD3和CD4。缓冲液洗涤一次，离心完全弃上清。斡旋分散细胞。3、加100ul IC Fixation buffer ，斡旋固定细胞。室温避光孵育20min。4、每管加2ml 1permeabilization buffer。5、300g 室温离心5min,弃上清。6、2ml 1permeabilization buffer重悬细胞。7、300g 室温离心5min,弃上清。8、加100ul 1permeabilization buffer 重悬细胞后，加入二抗IL-17A （或其他胞内抗原抗体），室温避光孵育20min。9、2ml 1permeabilization buffer洗一次，300g 室温离心5min,弃上清。10、加2ml 流式染色液，300g 室温离心5min,弃上清。11、适量流式染色液重悬即可上机检测。同行对照依照上述步骤进行。软件分析结果。方案B：一步法胞内（细胞核）蛋白染色实验材料：1275mm 圆底检测流式管。可选可固定的活度染料eFluor 450 (eBioscience Cat. No. 65-0863), eFluor 660 (eBioscience Cat. No. 65-0864)，eFluor 780 (eBioscience Cat. No. 65-0865)。胞内抗原的直标抗体。Foxp3 Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent (eBioscience Cat. No.00-5521)Permeabilization Buffer (10X) (eBioscience Cat. No. 00-8333)双蒸水稀释成1。Flow Cytometry Staining Buffer (eBioscience Cat. No. 00-4222)（可以自己配置）。注意：Foxp3 Fixation/Permeabilization Concentrate 1份加3份 Diluent 稀释为工作液（1:4稀释）。实验方案：1、按照流式样品要求制备单细胞悬液。2、按照流式表面染色方法标记CD3和CD4。缓冲液洗涤一次，离心完全弃上清。斡旋分散细胞。3、加1ml Foxp3 Fixation/permeabilization 工作液，斡旋固定细胞。室温或四度避光孵育30-60min（小鼠样品最长可以四度固定18小时）。4、每管加2ml 1permeabilization buffer。5、300g 室温离心5min,弃上清。6、2ml 1permeabilization buffer重悬细胞。7、300g 室温离心5min,弃上清。8、加100ul 1permeabilization buffer 重悬细胞后，加入二抗FOXP3 （或其他胞内抗原抗体），室温避光孵育20min。9、2ml 1permeabilization b