体外药物敏感试验研究.doc

体外药物敏感试验研究 -282生堡捡验匿堂苤壶!Q塑生!月星丝鲞箜!魍垦!垫!坐丛型丛垦望!Q堕!吐丝，堕垒!真菌性角膜炎致病菌种的变迁及体外药物敏感试验研究孙士营翟华蕾史伟云赵靖赵格谢立信临床微生物学研究【摘要】目的回顾分析2000-xx年山东省真菌件角膜炎致病菌菌种的分布、变迁及部分常见致病菌对抗真菌药物的敏感性。 方法对真菌性角膜炎患者的溃疡组织刮片和角膜移植术中取下的病变角膜片标本进行真菌培养及菌种鉴定，分析致病菌的构成及其随年份的变化和山东省眼科研究所开展真菌体外药敏试验以来的试验结果。 结果2000-xx年间，共有898例患者诊断为真菌性角膜炎，770例(857)真菌培养阳性。 其中首位的致病菌属为镰刀菌属(547例，710)，历年百分比分别为755、728、715、752、76、688和564；曲霉菌属(84例，109)是第2位的致病菌，历年所占百分比为151、152、131、102、104、80和69；链格孢属(74例，96)位居第3位，历年所占百分比分别为19、33、37、66、88、120和297。 镰刀菌属主要菌种为茄病镰刀菌(338)、尖抱镰刀菌(282)与串珠镰刀菌(274)；曲霉菌属主要菌种为黄曲霉(536)与烟曲霉菌(393)。 常见真菌对两性霉素B、特比萘芬、伊曲康唑、5氟胞嘧啶和氟康唑M IC值的几何均数分别为0 647、0 714、1 624、15108和27070IJ e,m l。 镰刀菌属5种抗真菌药物M IC的几何均数分别为0 899、0 893、3 077、37124和21687l培,m l；曲霉菌属分别为0 794、0 591、0 416、23973和7127斗sm l；链格孢属分别为0 409、0 479、0 433、11655和7104嵋,m J。 结论镰刀菌属、曲霉菌属和链格孢属是山东省真菌性角膜炎前3位的致病菌属。 2000至xx年间，镰刀菌属始终居于真菌性角膜炎致病菌的首位；其次为曲霉菌属，比例呈下降趋势；链格孢属居于第3位，比例璺逐年升高趋势。 镰刀菌属对两性霉素B和特比荼芬M IC值的几何均数低，对伊曲康唑、5一氟胞嘧啶和氟康唑M IC值的几何均数高。 曲霉菌属和链格孢属对5种抗真菌药物M IC值的几何均数较镰刀菌都低。 【关键词】角膜炎；眼感染，真菌性；微生物敏感性试验Pathogens di versi tyandi nvi trodrugsensi ti vi tytesti nfungall ei，Si l l Weiyun，zH AoJ i鸭，ZH AOG e，XIELi-xi nShangdongEye InstituteQ i ngdao266071，Chi nakerati ti sS叭f鼢i一埘昭，ZHAIH uaCorrespondi ngauthorXIELi一茗讥，Em ail l讧i nx&publ icq,t【Abstract】obj ectivedrugs i nfungal kerati ti sduri ng2000xxi nShandong provi nceM ethodsSampl esfrom coruea_Ii denti fi cationThe distri bution anddiversi tyof thepathogensi ndi fferentyearsw ereanal yzedThe sensi tivi tyof80m e m on speci es tOantifungal drugsw ere testedResul tskeratiti s，i nw hi ch770(857)w ereposi tivei nfungalfongal i nfecti on werei denti fi edof w hi ch547cases were causedby Fusari um(710)The prevelenceofFusari umfrom2000toxxW as755，728715752，76，688andsd Cr,Toanal yzethedistri bution，diversi ty，andthesensi tivi tyof m onpathogenspeci estoantifungalscrapi ngsandcorneaJ buttonsfromkeratopl astiesw ereused forfungalcuhureandA totalof898pati entsweredi agnosed粕i n748cases causalfongalculturePathogensby564respecti vel yEi ghtyfour131102104，80and69of 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were0409，0479，0433，11655and7104斗gIIl l，respecti velyConcl usionsand Alternari awel t吧the predomi nantProviliceD uring2000一xx几ari umWaSpercentageof Aspergi U usdecreased annually111e third mosttheperi odThe geometricmean M ICsi traconazole，5-fl ucytosine andflueonazol e111e M ICsAspergi ll usandAlternati a【Key words】Kerati ti s；Eye infecti ons，fungal；M i crobi alsensitivitytestsw ere0794，0591，0416，23973and7127ttgm l，respecti vely；forG enusFusarium，AspergiU uspathogens mon one。 f oll owed bypathogenAternarai ncreasedduringof amphoteri ein Band terbinafinagai nstthesefi veantifun【gaJw ere l ow er thanthose forFusariumi nfungalkerati ti sinShandongthem ostAspergiUusThecol nif lof lFusarium werelowerthanthose ofofdrugsagainst真菌性角膜炎是全球范围常见的致盲性眼病?。 近年来，该病的发病率在我国呈现逐年上升趋势怛圳，已成为眼科常见而治疗较为棘手的眼部感染性疾病之一。 由于不少患者早期诊断不明确，治疗不及时，同时临床缺乏广谱高效的抗真菌药物，导致多数真菌性角膜炎患者需要接受手术治疗，手术方式以角膜移植术居多。 我们对山东省眼科研究所2000年1月至xx年12月间真菌性角膜炎致病菌的分布、变迁以及部分常见致病菌的抗真菌药物试验结果进行了回顾性分析，以期为真菌性角膜炎的临床治疗提供参考。 对象与方法1对象2000-xx年山东省眼科研究所诊断为真菌性角膜炎的患者，共898例。 纳入标准角膜溃疡合并以下任意一项检查结果为阳性者。 引 (1)10氢氧化钾涂片或共聚焦显微镜检查发现菌丝； (2)角膜溃疡组织刮片标本或角膜移植术中取下的病变角膜片行真菌培养发现真菌生长； (3)病变角膜片行组织病理学检查发现菌丝或孢子等真菌成分。 对培养阳性的患者进行分析统计，而培养阴性的患者的予以排除，不计人统计。 2标本采集及真菌培养对所有患者常规行角膜溃疡组织刮片和真菌培养。 局部表面麻醉后，在手术显微镜下用无菌刀片小心地刮取角膜溃疡边缘或底部的组织，直接接种于沙氏平面培养基，27温箱孵育14d。 对于接受角膜移植术的患者，将术中取下的病变角膜片以同样的方法再次进行真菌培养。 3真菌鉴定对于真菌培养阳性的患者，根据菌落形态、性状、颜色等并结合显微镜下菌丝、孢子的大小、形态等特征对致病真菌进行初步分类至菌属。 然后将临床常见的角膜致病菌属接种于特征性培养基镰刀菌采用马铃薯葡萄糖琼脂(potatodextrose agar，PDA)培养基，曲霉菌和青霉菌采用察氏(CzapekDox agar，CDA)培养基，酵母菌属转种于科玛嘉培养基，采用美国德灵公司的M icroScanautoSCAN4微生物鉴定仪进行鉴定；对种类较多的镰刀菌和罕见的菌株同时做方块法小培养，27温箱孵育后结合显微镜下菌丝、孢子的大小、形态及排列规律等特点进行菌种鉴定J。 以上进行的病原学检查由山东省眼科学重点实验室下设病原学研究室完成，少数难以鉴定的菌株由北京大学第一医院皮肤科真菌实验室和中国医学科学院皮肤病研究所(南京医学微生物真菌菌种保藏管理中心)协助鉴定。 4药敏试验对149株菌株进行了体外抗真菌药物敏感试验。 根据美国临床和实验室标准化协会(CLSD制定的M一38A方案(微量稀释法)进行操作，质控菌株为近平滑念珠菌ATCC22019。 96孔药物试验板上包被的抗真菌药物包括两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、特比萘芬和5一氟胞嘧啶。 将受试菌株转种到PD A培养基中35培养27d，取无菌生理盐水2IIl l，注入到培养皿上，轻轻晃动使受试菌株孢子脱落。 然后把菌液转移至无菌玻璃试管中震荡后静置5min，取上清液用血细胞计数板计数孢子数量，并调整菌液终浓度至(055)104m l。 在96孔板的每个孔内加入00p1菌液，置入35恒温箱中培养48h，根据M38一A方案的要求读取M l C值。 结果1真菌性角膜炎的致病菌分布898份真菌性角膜炎患者标本中，770份(857)真菌培养阳性。 除22份未能明确致病菌外，其余748份通过真菌鉴定明确了致病菌，包括12个菌属27个菌种。 最常见的角膜致病菌属为镰刀菌属(547份，71O)，其次为曲霉菌属(84份，109)，再次为链格孢属(74份，96)。 其他致病真菌例如念珠菌属(11份，14)与青霉菌属(10份，13)少见(表万方数据主堡捡坠匿堂盘查!Q塑生!旦墓!鲞筮!翅g蝤!坐丛型丛!些!Q塑!生!塑垒11)。 由此可见，镰刀菌属的主要菌种依次为茄病镰刀菌185份(338)、尖孢镰刀菌154份(282)与串珠镰刀菌150份(274)；曲霉菌属的主要菌种为黄曲霉菌45份(536)与烟曲霉菌33份(393)。 表l2000至xx年山东省真菌性角膜炎致病荫分布2常见角膜致病菌属的变迁2000-xx年，镰刀菌属始终是真菌性角膜炎最常见的致病菌属，其百分比分别为755、728、715、752、76、688和564；曲霉菌属是第2位的致病菌，所占百分比分别为151、152、131、102、104、8O和69，呈现下降的趋势；位居第3位的链格孢属有逐年增加的趋势，所占百分比分别为19、33、37、66、88、120和297。 3常见角膜致病菌种的变迁2000-xx年茄病、尖孢、串珠镰刀菌始终是前3位的致病菌种，但是在不同的年份，这3个菌种在角膜致病真菌中所占的比例是波动的。 茄病镰刀菌在 2000、 xx、xx和xx年中是首位的角膜致病真菌，其所占百分比分别为302、256、272和216；xx年最多见的病原菌为尖孢镰刀菌(283)；而xx年串珠镰刀菌成为第1位的角膜致病真菌(256)。 曲霉菌属中，除2000年黄曲霉菌与烟曲霉菌在角膜致病真菌中的比例(75)相同外，其他年份中黄曲霉菌的比例均高于烟曲霉菌。 链格孢霉从2000-xx所占比例逐年上升，特别是xx至xx年间增长迅速，成为第1位的致病菌种(297)。 图l2000-xx年常见角膜致病菌属的比例变化圈2xxY-xx年常见角膜致病菌种的比例变化4常见角膜致病真菌对药物的M IC见表2。 常见真菌对两性霉素B、特比萘芬、伊曲康唑、5-氟胞嘧啶和氟康唑M1C值的几何均数分别为0 647、0 714、1 624、15108和27070It,gm l。 镰刀菌属对5种抗真菌药物M IC值的几何均数分别为0 899、0 893、3 077、37124和21687“gm l；曲霉菌属分别为0 794、0 591、0 416、23973和7127表2常见真菌对抗真菌药物的M IC值及几何均数(斗grnJ)注G M为几何均数万方数据主堡捡墅医堂盘盍!Q堕生三月筮丝鲞星!拐曼垒也l尘!鲤丛坚12Q堕!吐丝堡垒三“gm l；链格孢属分别为0 409、0 479、0 433、11655和7104IIll。 讨论镰刀菌和曲霉菌等丝状真菌是世界大部分地区报道的最常见的角膜致病真菌，尤其是在热带和亚热带地区。 7J0。 其中镰刀菌是大多数国家和地区主要的致病菌，按从多到少的次序排列依次为茄病镰刀菌、尖孢镰刀菌和串珠镰刀菌1u；曲霉菌是气候温和地区和印度大部分地区常见的角膜致病菌1115J，主要菌种为烟曲霉菌和黄曲霉菌。 而在一些发达国家的部分地区一“引，致病菌以念珠菌为主，最常见为白念珠菌。 山东省第l位的角膜致病真菌为镰刀菌属。 镰刀菌在自然界中广泛存在，是气候湿热地区农业劳动者最常见的角膜致病真菌9。 镰刀菌主要寄生在农作物上，而植物性外伤是真菌性角膜炎的重要危险因素加1。 山东是农业大省，这可能是镰刀菌在山东省角膜致病真菌中占绝对优势的主要原因。 曲霉菌属是多数国家和地区报道的真菌性角膜炎第1位或第2位的致病菌，主要菌种为烟曲霉菌和黄曲霉菌。 本研究结果显示，除2000年2者在角膜致病真菌中所占的比例(75)相同外，其他年份黄曲霉菌的比例均高于烟曲霉菌。 而河北、广东省的报道显示烟曲霉菌比黄曲霉菌更常见川；尤其是广州地区，烟曲霉菌的比例(251)远远高于黄曲霉菌(20)，这种差异可能主要与南北方的气候差异有关【2引。 河南地区的调查结果显示黄曲霉菌是曲霉菌属中最多见的角膜致病真菌，与本研究结果一致口L川。 此外，国外部分研究也表明黄曲霉菌的比例高于烟曲霉菌814J，因此有必要进一步加强对黄曲霉菌的相关研究。 随着时间的变迁，北京24矧、河南汹1和广东省1真菌性角膜炎临床患者分离的致病菌中，镰刀菌属的比例呈上升趋势，而曲霉菌呈现下降趋势，这与我们的统计结果存在一定差异镰刀菌在山东省角膜致病真菌中所占的比例明显高于其他地区；且近年来比例略有下降。 曲霉菌的比例低于其他地区，呈现下降趋势。 链格孢属是山东省第3位的角膜致病真菌。 有研究报道显示i24甄驯，临床分离的角膜致病真菌中链格孢属的比例均明显增加，这提示我们链格孢属已经成为近年来临床上重要的角膜致病菌种。 尽管国外对链格孢属的相关报道较少且多数为个案报道瑚瑚驯，但链格孢霉菌性角膜炎应该引起国内外眼科医师的重视。 致病真菌对常用抗真菌药物的体外药敏试验显示，镰刀菌、曲霉菌、链格孢霉对两性霉素B和特比萘芬M IC值的几何均数均较低，虽然镰刀菌对伊曲康唑、5氟胞嘧啶和氟康唑MIC值的几何均数较高，但临床应用中也存在真菌MIC值高而用药效果好的情况，提示我们在治疗中要合理分析真菌体外药物敏感试验结果。 曲霉菌属和链格孢属对两性霉素B、特比萘芬、伊曲康唑、5一氟胞嘧啶和氟康唑MIC的几何均数值都较低，这些菌种导致的感染在用药选择上余地较大，治疗效果也不错。 尤其是链格孢属，临床上多用药治疗即可痊愈。 总之，2000至xx年，镰刀菌属、曲霉菌属和链格孢属是山东省最常见的角膜致病真菌；曲霉菌属比例呈现下降趋势；链格孢属比例呈现逐年升高趋势。 常见致病真菌对两性霉素B和特比萘芬的MIC较低，对伊曲康唑、5一氟胞嘧啶和氟康唑的MIC值高。 我们应注意致病菌种的变迁，对出现的新情况及时应对。 重视抗真菌药物的体外药敏试验对临床治疗的参考价值，并积极探讨联合药物治疗的新方案，以提高临床治疗效果。 参考文献1Sri nivasan MFungalkerati ti sCurt Opi nO phthal m ol，xx15321-3272Xi eL，D ongx，Shiperati ngkeratoplastyBr J O phthal m ol，200l，85107010743Xi eL，ShiW，Li uzetReatm entoffang keratitisCornea，xx。 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ology，1994，10110051013furl g且l万方数据286生堡撞验医堂盘圭!Q塑生!旦墓丝鲞筮!魍垦b堕!坐丛型丛!堕!呈Q盟!丛丝盟!13U padhyayM P，Kam charyaPC，Koi rala S，et a1Epi demi ologl echaracteristi cspredi sposing factors，andcorneal ulcerati oni nNepalAmJ Ophthahn011991，1592-99【14Basak SK，Basak S。 M ohanmA，etm ierobi ologcal diagnosi sofbengaleasternIndi aIndi anJO phthalm ol，xx，5317-2215Vem ugantiG K。 G argP，G opinathanU，et a1Eval uationofagentand hostfactors in progression ofm ycoticand mi crobi ologi c studyof167cornealxx，1091538-154616Tanure MA，Cohen EJ，Sudesh S，etkerati tisatw iseyehospi tal，Phi ladel phia，Pennsyl vaniaCornea，2000，9307-31217Rondeau N，Bourci erT，Chaum eilC。 el a1Fungithe centrehospital iernati onaldO phtalm ologi edesquinzevi ngtsretrospective studyof19ca8c8J896eti ologicdiagnosisofa1Epi demi ologi calandsuppurativekem titis ingangeti cwestkerati tisAhi stologi ebuttonsO phthalm ology，a1Spectrumoffunoakerati tis砒FrO phtalm01xx25890-18Bharti yaP，D anielM，Constanti nouM，et a1Fungalreel bourneCl inExperi ment 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