发酵工程第二章 工业发酵菌种选育

第二章 工业发酵菌种选育,工业发酵生产水平取决于,生产菌种,发酵工艺,提取工艺,第一节 工业发酵生产菌种,一、微生物代谢产物的类型,1.初级代谢产物：微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质。如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。,2.次级代谢产物：微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该微生物无明显生理功能，或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质。如抗生素、毒素、激素、色素等。,两者之间的关系：P12,二：工业化菌种的要求,能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成 产物,有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的 可操作性要强,遗传性能要相对稳定,不易感染其它微生物或噬菌体,生产菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病 菌无关）,生产特性要符合工艺要求,三、 工业上常用菌种,细菌（bacteria）：常用的有枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。,啤酒酵母,棒状杆菌,短杆菌 棒状杆菌,yeasts,短杆菌：GA、Gln、lys枯草芽孢杆菌：淀粉酶（BF7658）、碱性蛋白酶等地衣芽孢杆菌：HASS(耐高温-淀粉酶) -Amylase苏云金芽孢杆菌：BT生物农药梭状芽孢杆菌：丙酮、丁酸等的发酵,酵母菌（yeast）：属单细胞真核生物，主要分布于含糖较多的酸性环境中。常用的有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等。,啤酒酵母：酿酒、辅酶类物质的发酵酒香酵母：酿酒汉逊酵母：酿酒，用于乙酸乙酯的发酵假丝酵母：单细胞蛋白生产，石油发酵,霉菌（mould）：喜偏酸性环境。可用于生产多种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等。,放线菌,霉菌,黑曲霉：柠檬酸工业、酿酒业、糖化酶黄曲霉：酱油生产，面酱青霉菌：青霉素的生产红曲霉：红曲制造，南方红曲酒（女儿红）；红色；豆腐乳赤霉菌：赤霉素的生产,放线菌（actionmycetes）：原核微生物类群。在含有机质丰富的微碱性土壤中分布较为广泛。主要用于生产多种抗生素。,担子菌（basidiomycetes）：主要用于多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发。藻类（alga）：许多国家已把它作为人类保健食品和饲料。还可通过藻类将CO2转变为石油；国外还有从“藻类农场”获得氢能的报道。,硅藻,担子菌,微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有特定的微生物才具有大量表达的潜力。,问题：,生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？,礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。,例：,菌种选育,经验育种,自然选育,诱变育种,主要通过突变和筛选来育种,定向育种,杂交育种,分子育种,常规的杂交育种,原生质体融合,通过DNA重组技术来育种,第二节 工业发酵生产菌种来源,从菌种保藏机构获得菌种选育,（一）从自然界分离菌种,目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物,（）采样和采集方法,为了从一特定生态系统中分离出具有代表性的细菌菌群，特别是分离那些在唯一微环境区域中出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样采集器、镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。,采样的注意事项,1、采样时应尽可能保持相对无菌；2、所采集的样本必须具有某种代表性；3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等；4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的；5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长,土样采集方法,森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层向上层顺序采集；水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆筒采集。如果层次要求不严格，可取离地面515cm处的土。将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。在采集植物根际土样时，一般方法是自土壤中慢慢拔出植物根，在大量无菌水中浸渍约20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下根部残留的土，这部分上却为根际土样。,植物体采集方法,在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔器、安全刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位切取一小块，并注意不要损伤周围边缘。选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在一片叶上的取样部位。采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法相似。将洗净的根装入采样袋中，采集根系时，一般与根际土样一起保存。,水样采集方法,用于细菌检测的水样应收集于100m1干净、灭菌的广口塑料瓶中。由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静水层中采集水样。方法是：握住采样瓶底浸入水中30-50cm处，然后瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话，应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水中取出时应迅速并带有较大的弧度。水样不应装满采样瓶。所有水样都应在24h之内迅速进行检测，或者4下贮存。,富集的三种方案：,定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的 条件，进行培养。,（二）增殖培养,目的：,富集目的微生物，让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。,当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑，,不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法,定向培养的富集方法,1、养分,2、pH条件,3、培养时间,4、培养温度,等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。,（）纯种分离,尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。,倾注平板,接种和分离工具1接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀,挑菌落,纯化（平板划线法）倒平板划线培养挑菌落纯种（纯培养）,isolation plate,制备土壤稀释液,菌落的选出,从产物角度出发,在培养时以产物的形成有目的的设计培养基,利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素,从形态的角度,菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。,实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选,采样（造纸厂）,80度30分钟处理,文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌,0.0075%曲利本蓝1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5培养34天，选择有凹陷圈的菌落,从285个土样中获得62株,26株为组成型,36株为诱导型,（）生产性能的测定,这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。这种直接从自然界分离得到的菌株称为野生型菌株，以区别于用人工育种方法得到的变异菌株。,（5）毒性试验,自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。,（二）诱变育种,以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率很低，一个基因的自然突变频率仅10-610-10左右。诱变育种：以诱发突变为基础的育种，是国内外提高菌种产量、性能的主要手段。,诱变育种：用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种。,诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂,诱变剂,物理：紫外线，快中子，X射线，射线，激光,化学：碱基类似物、与碱基反应的物质 生物诱变剂,确定出发菌株 菌种的纯化选优 出发菌株的性能鉴定同步培养 制备单细胞（或单孢子）悬液 活菌浓度测定诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验 诱变处理 平板分离 计形态变异的菌落数，计算突变率挑取疑似突变菌落纯培养 突变体的初步筛选 用简单快捷的方法重复筛选 摇瓶发酵试验选出突变体（根据情况进行生产试验或重复诱变处理）,二、微生物的诱变育种,出发菌株的选择,1自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。2在生产中的菌株因经多次诱变，应考虑新的诱变方法。3. 要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，,处理菌悬液的制备,这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。,诱变处理,根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。,分离和筛选,筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异. 例如初筛可以在平皿上形成的透明圈或抑菌圈的大小来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。,紫外线的诱变育种,紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为2537A灯与处理物的距离为1530cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在7080%为宜。,例,被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106107个ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.51.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。,(二)操作步骤 1将细菌培养液以3000rmin离心5min，倾去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。 2将菌悬液放入一巳灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达108个ml左右，作为待处理菌悬液。3取24m1制备的菌液加到直径9cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。在正式照射前，应先开紫外线10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射1050s。操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。,4取未照射的制备菌液和照射菌液各o.5ml进行稀释分离，计数活菌细胞数。 5取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三角瓶内装30ml培养液)，120rmin振荡培养46h。 6取中间培养液稀释分离、培养。 7挑取菌落进行筛选。,亚硝基胍诱变曲霉菌,亚硝基胍(MNNG)对真核或原核微生物都有强烈的诱变作用。其精确的作用机制尚不很清楚，据认为是伴随着重氮甲烷的生成及在酸性条件下生成亚硝酸，直接作用于细胞内的DNA复制系统，从而诱发了变异。,例,(二)操作步骤 1单孢子悬液制备 取斜面，加入6ml 0.1molL pH6.o的磷酸缓冲液，用接种环刮下孢子，振荡试管，立即通过带滤纸漏斗过滤，由此制得单孢子悬液，若孢子液浑浊状，其孢子浓度可达l06个ml，此为待处理孢子悬液。2MNNG溶液的制备 用分析天平称取2mg，加入2ml 0.1molL pH 6.0磷酸缓冲液，于暗处振荡溶解。,3诱变处理 吸取MNNG溶液lml，加入到1m1孢子悬液中，30振荡30min，立即稀释1000倍停止作用，然后以10-4稀释度分离培养，30 3天后计数。 4挑取菌落进行糖化酶及蛋白酶产量筛选,（三）杂交育种,指两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体融合使遗传物质重新组合，再从中分离筛选具有新性状的菌株。,融合,生长快、产量高,菌B生长快，产量低,菌A生长慢，产量高,细胞壁,细胞壁溶解酶,细胞膜,营养细胞,原生质体,原生质体融合,融合细胞,原生质体形成,原生质体融合,细胞壁再生,原生质体融合的基本过程,（1）原生质体融合,影响原生质体融合的主要因素,菌体的前处理菌体的培养时间融合剂的浓度融合剂作用的时间阳离子浓度融合的温度及体系的pH值等,影响原生质体再生的主要因素,菌体自身的再生性能原生质体制备的条件再生培养基成分再生培养条件等,（2）基因重组,把外源DNA分子结合到任何病毒、质粒、或其它载体系统中，组成新的遗传物质，并转入宿主细胞内进行繁殖的过程。,可以从复杂的DNA分子中分离出单独的DNA片段。可以大量生产高纯度的基因片段及其产物。可以在大肠杆菌中研究来自其它生物的基因。在高等动植物中也可以发展和建立这种基因操作系统。,基因重组过程,目标DNA片段的获得,与载体DNA分子的连接,重组DNA分子引入宿主细胞,筛选含有所需重组DNA分子的宿主细胞,对外源基因的表达及稳定性的鉴定,第三节 菌种的保藏与复壮,微生物菌种的衰退菌种的复壮菌种的保藏,一、菌种的衰退,微生物个体特征微生物群体特征,各方面发生变化,营养物质代谢和生长繁殖能力下降,发酵周期延长,抗不良环境的性能减弱,目的产物的产量下降,1、菌种退化的原因： 基因突变；变异菌株性状分离；诱变的单菌落是由个以上孢子或细胞形成菌落由个孢子或单个细胞形成，但它是多核细胞单核孢子发生突变时，双链DNA上仅条链上某个位点发生变化,连续传代其它因素菌种保藏不当 生长条件不满足（培养基组成、培养条件）,2、防止衰退的措施1）减少传代次数；2）创造良好的培养条件；3）利用单核体传代4）经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查；5）采用有效的菌种保藏方法；,二、菌种的复壮,1）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种。a）纯种分离；b）通过寄主体进行复壮；c）淘汰已衰退的个体；2）有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种维护工作中不断筛选“正变”个体。,(一)菌种的提纯,即从已衰退的菌种中，通过分离纯化，将尚未退化的个体分离出来，以恢复和建立具有原来生产性状的群体，继续供科研及生产使用。菌种提纯