金桔组织培养及其形态发生与生理生化变化

Q260046902 专业做论文 分类号 密级 U D C 编号 G20020249 学学 位位 论论 文文 金桔组织培养及其形态发生与生理生化变化金桔组织培养及其形态发生与生理生化变化 Tissue culture of Fortunella margarita Lour Swingle and it s morphological and physiol biochemical changes 曾 明 指导教师姓名 指导教师姓名 杨柏云 教授 南昌大学生命科学学院 申请学位级别 申请学位级别 硕 士 专业名称 专业名称 植 物 学 论文提交日期 论文提交日期 2005 年 5 月 论文答辩日期 论文答辩日期 2005 年 6 月 学位授予单位和日期 学位授予单位和日期 南昌大学 2005 年 6 月 答辩委员会主席 答辩委员会主席 评阅人 评阅人 2005 年 5 月 日 I 目目 录录 摘摘 要要 IV Abstract V 引引 言言 1 文献综述文献综述 2 1 1 植物组织培养概述植物组织培养概述 2 2 2 组织培养在柑桔研究中的应用组织培养在柑桔研究中的应用 2 2 1 遗传育种 3 2 1 1 杂种育种 3 2 1 2 单倍体育种 3 2 1 3 三倍体育种 无核育种 4 2 1 4 抗性育种 4 2 2 无病毒苗培养 5 2 3 离体种质保存 6 2 4 组织形态学研究 7 2 5 生理生化研究 7 2 6 柑桔基因工程 8 3 3 问题与展望问题与展望 9 4 4 本研究的意义本研究的意义 9 材料与方法材料与方法 11 1 1 材料材料 11 2 2 方法方法 11 2 1 金桔上胚轴离体培养再生体系的建立 11 2 1 1 愈伤组织的诱导 11 2 1 2 愈伤组织的分化 12 2 1 3 生根培养 12 II 2 2 离体培养过程中解剖学观察 13 2 2 1 愈伤组织诱导过程的解剖学观察 13 2 2 2 愈伤组织分化过程的解剖学观察 13 2 3 离体培养过程中同工酶变化 13 2 3 1 酶样的制备 13 2 3 2 电泳贮液配制 14 2 3 3 电泳 14 2 4 可溶性蛋白含量变化的测定 16 2 4 1 愈伤组织诱导阶段取样 16 2 4 2 愈伤组织分化阶段取样 16 2 4 3 蛋白质含量测定 16 结果与分析结果与分析 17 1 1 金桔上胚轴离体培养体系的建立金桔上胚轴离体培养体系的建立 17 1 1 愈伤组织的诱导 17 1 2 愈伤组织的分化 18 1 3 根的诱导 19 2 2 离体培养过程中的解剖学观察离体培养过程中的解剖学观察 20 2 1 上胚轴的解剖学观察 20 2 22 2 愈伤组织诱导过程中的解剖学观察愈伤组织诱导过程中的解剖学观察 20 2 32 3 愈伤组织分化过程中的解剖学观察愈伤组织分化过程中的解剖学观察 20 3 3 离体培养过程中几种同工酶的变化离体培养过程中几种同工酶的变化 21 3 1 过氧化物酶 POD 的变化 21 3 2 超氧化物歧化酶 SOD 的变化 22 3 3 过氧化氢酶 CAT 的变化 22 3 4 苹果酸脱氢酶 MDH 的变化 23 4 4 上胚轴上胚轴离体培养过程中可溶性蛋白含量的变化离体培养过程中可溶性蛋白含量的变化 24 4 1 愈伤组织诱导阶段可溶性蛋白含量变化 24 4 2 愈伤组织分化阶段可溶性蛋白含量变化 24 III 讨讨 论论 25 1 1 愈伤组织的诱导与分化愈伤组织的诱导与分化 25 1 1 外植体因素 25 1 2 激素对愈伤组织诱导的影响 26 1 3 激素对愈伤组织分化的影响 26 2 2 生根培养生根培养 27 3 3 离体培养中解剖学化特点离体培养中解剖学化特点 27 4 4 同工酶变化与愈伤组织诱导和分化的关系同工酶变化与愈伤组织诱导和分化的关系 28 5 5 可溶性蛋白含量变化与愈伤组织诱导和分化的关系可溶性蛋白含量变化与愈伤组织诱导和分化的关系 29 结结 论论 31 参考文献参考文献 32 附图附图 36 致致 谢谢 38 IV 摘摘 要要 本研究以金桔上胚轴为离体培养材料 研究了愈伤组织诱导和器官发生的适宜条 件 建立离体培养再生体系 通过石蜡切片观察了离体培养过程中外植体形态发生的 变化过程 用紫外分光光度法和聚丙烯酰胺凝胶电泳分别研究了离体培养过程中可溶 性蛋白含量和几种同工酶的变化 实验结果表明 6 BA 和 NAA 适当浓度配比对离体 诱导和分化有促进作用 愈伤组织诱导以 6 BA 1 5mg L NAA 1 0mg L 为佳 第 24d 愈伤组织增长 20 3 倍 愈伤组织分化以 6 BA 1 5mg L NAA 0 5mg L 为佳 分化率为 75 生根培养时 较高的 NAA 浓度 1mg L 易产生愈伤组织 较低浓度无机盐有 利于生根 以 1 2 MS NAA 0 5mg L 较好 金桔上胚轴离体再生为器官发生型 芽体 多由愈伤组织内部形成 少数由愈伤组织表面发生 过氧化物酶 POD 中 POD1与诱 导过程的启动有关 POD2 POD5和 POD6在诱导 12d 天出现 是愈伤组织快速增殖的 标志 POD4在一开始诱导就消失 到分化培养第 24d 再现 与芽的形成有关 超氧化 物歧化酶 SOD 中 SOD3在愈伤组织诱导第 12d 消失 是愈伤组织快速增殖的标志 SOD2和 SOD6均在分化第 24d 出现 是形成芽的标志 过氧化氢酶 CAT 只出现一 条酶带 其稳定表达 对维持细胞代谢环境的稳定有重要作用 苹果酸脱氢酶 MDH 在诱导阶段逐渐变强 在出芽前后有一个波动 MDH4在诱导第 2d 出现 到 分化第 24d 后消失 可能为离体培养中特殊生理代谢所需 可溶性蛋白含量在愈伤组 织诱导阶段 呈现 W 形变化 第 4d 时出现一个小峰 之后呈上升趋势 这与诱导 过程的启动及愈伤组织增殖相一致 在愈伤组织分化阶段呈 U 形变化 分化第 1d 18d 逐渐下降 之后又上升 这与愈伤组织分化初期消耗可溶性蛋白及新芽发生时蛋白 质快速合成相一致 关键词 金桔 离体培养 形态发生 同工酶 V Abstract Epicotyls of Fortunella margarita Lour Swingle were cultured in vitro in this study To set up the in vitro regeneration system the conditions for callus induction and organogeny were studied The morphologic change during culture was observed through paraffin slice the content of soluble protein was mensurated through ultraviolet spectrophotography and changes of isozymes were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis The results indicated as follows Appropriate combination of 6 BA and NAA can be effective in callus induction and redifferentiation The optimal concentration for callus induction is 6 BA 1 5mg L NAA 1 0mg L with the increment of 20 3 times on 24th day as for callus differentiation is 6 BA 1 5mg L NAA 0 5mg L with the differentiation rate of 75 The in vitro regeneration of Fortunella margarita Lour Swingle epicotyl is organogeny type most buds are formed inside the callus some are originated from surface During root induction relatively high concentration of NAA 1mg L was easy to produce callus and relatively low concentration of salt is good for rooting 1 2MS NAA 0 5mg L is preferable Among the peroxidase POD POD1 has relation to the startup of induction and proliferation POD2 POD5 and POD6 appeared on the 12th day of induction they are signs of the fast increase of callus POD4 disappeared since the beginning of induction but reappeared on the 24th day of differentiation it s has relation to buds forming Among the superoxide dismutase SOD SOD3 disappeared on the 12th day of callus induction it is also a sign of the fast increase of callus SOD2 and SOD6 appeared on the 24th day of differentiation they are the signs of bud forming Catalase CAT showed only one band it s stable expression is important for maintaining the stabilization of cell metabolism circumstance Malic dehydrogenase MDH got intense during callus induction but showed a fluctuation when buds emerged MDH4 appeared since the 2nd day of callus induction but disappeared on the 24th day of callus differentiation it maybe needed in special physiological process of in vitro culture During callus induction the concentration of soluble protein presented W shape change there was a little pick on 4th day and went up after that this is consistent to the startup of induction and increase of callus during callus differentiation the concentration of soluble protein presented U shape change from 1st to 18th day it fell but went up later this is related to the consumption of protein during early stage of differentiation and fast synthesis in bud forming Zeng Ming Botany Directed by Prof Yang Boyun Keywords Fortunella margarita Lour Swingle in vitro culture morphogenesis isozyme VI 引引 言言 金桔 Fortunella margarita Lour Swingle 属于芸香科金柑属 又名金柑 金枣 金橙等 是老幼皆宜的果品 可食部份含有较高的糖分 蛋白质 无机盐 粗纤维 脂肪 钙 磷 铁等 还含有多种维生素 尤其是维生素 C 维生素 P 和胡萝卜素含 量最为丰富 除鲜食外 尚可加工成桔瓣罐头 桔花茶 桔汁 汁胞桔汁 桔酱 桔 酒 桔汽水 桔蜜饯等 金桔还有较多的医疗用途 本草纲目 中说 食用金桔 同补药则补 同泻药则 泻 同升药则升 同降药则降 中医认为 金桔有理气 补中 解郁 消食 散寒 化痰 醒酒等作用 可用于治疗胸闷郁结 酒醉口渴 消化不良 食欲不振 咳嗽哮 喘等症 日本的医学杂志介绍 金桔能增强机体抗寒能力 可以防治感冒 降低血脂 对防治老年性疾病有益 金桔核可治眼疾 淋巴结核 咽喉炎等 金桔根有行气散结 的功效 可治胃痛 呕吐 疝气 淋巴结核等 金桔树形美观 四季长青 枝叶茂密 夏日开花 花色玉白 娇小玲珑 香气远 溢 秋冬果熟 或黄或红 点缀于绿叶之中 有 碧叶金丸 的美誉 是一种优秀的 园艺及盆景观赏植物 江西遂川号称 中国金桔之乡 遂川金桔与遂川板鸭 狗牯脑茶并称为 遂川三 宝 是全国有名的土特产品 2004 年 10 月 遂川金桔 商标在国家工商行政管理总 局商标局注册成功 遂川金桔这一名优特产有了自己的 身份证 同时也取得了进入 国际市场的 护照 因金桔果实内种子较少 枝条扦插不易生根 其传统繁殖方式主要采用嫁接手段 生产季节性强 限制了良种的发展 再者 长期嫁接育种会导致病毒积累 影响果实 品质及产量 利用植物组织培养技术进行金桔良种的培育可以克服常规方法费时费地 的缺点 为进一步进行无病原体苗木繁育 杂交育种及遗传转化创造有利条件 有关柑桔组织培养的研究 已有四十多年的历史 在胚培养 原生质体培养及融 合 茎尖嫁接脱毒等方面都取得不少成绩 但金桔的组织培养开展得不多 且与实际 应用还有较大距离 本研究以金桔上胚轴作为外植体 通过诱导愈伤组织和器官发生 1 建立无性繁殖体系 对金桔上胚轴离体培养条件 组织形态变化 可溶性蛋白含量和 一些同工酶变化的研究 可为金桔离体器官发生途径的生理生化研究提供一定参考 同时为金桔良种繁育和工厂化生产提供一些理论依据 文献综述文献综述 1 1 植物组织培养概述植物组织培养概述 植物组织培养 plant tissue culture 是指在无菌条件下 将离体的植物器官 组织 细胞以及原生质体 培养在人工配制的培养基上 给予适当的培养条件 使其长成完 整的植株 由于培养的是脱离植物母体的培养物 所以也叫植物离体培养 in vitro culture of plant 或植物试管培养 plant culture in test tube 植物组织培养的基本原理是植物细胞的全能性 totipotency 学说 即植物细胞具有 个体生长发育的全部遗传基因和潜能 在适当的条件下 可以通过特殊的途径分化发 育形成一个完整的植物个体 该学说是 1902 年德国著名的植物学家 Haberlandt 根据细 胞理论提出的 1958 年 英国学者 Steward 和 Shantz 在胡萝卜根韧皮部细胞悬浮培养 中成功地诱导形成了胚状体 并由胚状体发育形成完整植株 第一次证实了植物细胞的 全能性 1964 年印度的 Guha 和 Maheshwari 培养毛叶曼陀罗花药 得到了由小孢子发 育而来的单倍体植株 证明了生殖细胞和体细胞一样 在离体条件下也能表现其发育 成完整植株的潜在能力 近几十年来 植物组织和细胞培养技术得到迅速发展 大量 的植物无论是二倍体细胞 单倍体细胞还是原生质体离体培养均获得了再生植株 1 目前 胚培养 茎尖培养 细胞悬浮培养 原生质体培养 花药培养 体细胞杂 交 人工种子技术等在杂交育种 脱毒快繁 次生代谢产物生产 有用突变体的筛选 植物种质的保存及基因工程等方面得到广泛应用 2 此外植物组织培养技术已渗透到 植物生理学 病理学 药学 遗传学 育种以及生物化学等各个研究领域 成为生物 学科中的重要研究技术和手段之一 在农业 林业 工业 医药业等多个行业 产生 了巨大的经济效益和社会效益 成为当代生物科学中最有生命力的一门学科 2 2 组织培养在柑桔研究中的应用组织培养在柑桔研究中的应用 柑桔是热带和亚热带地区广为栽培的果树之一 其产量位居世界水果之首 国外 2 柑桔组织和细胞培养研究已有 40 多年历史 国内则始于 70 年代中期 近几十年来 柑桔组织和细胞培养各个领域均取得了可喜的成绩 继续深入研究将可能在柑桔品种 改良 无毒种苗生产等方面取得突破性进展 某些研究可望进入实用化 2 12 1 遗传育种遗传育种 2 1 12 1 1 杂种育种杂种育种 柑桔类果树的绝大多数种和品种普遍存在种子多胚现象 由于珠心胚侵入胚囊 合子胚发育受到严重抑制而早期败育 因此杂交之后难以获得杂种 这是柑桔杂交育 种的最大障碍 用离体培养的方法可以抢救合子胚 使之顺利发育形成杂种植株 另 外原生质体融合还可以有效地克服有性杂交不亲和的障碍 培养自然界不存在的新型 杂种 2 1 1 1 合子胚 有性胚 的培养 早期离体培养幼小合子胚 可克服珠心胚的干扰而提高杂种率 日本早在 60 年代 即开始用组织培养方法进行合子胚的挽救 随后美国和中国也相继开展了这方面的工 作 3 陈振光等 4 以雪柑 芦柑和柚为母本 分别用芦柑 福桔 枳和柚的花粉进行授 粉 并分别将授粉 50 55d 胚囊内仅有的一个合子胚培养成小植株 赵琦 5 和韦党扬等 6 将哈姆林甜橙 路比血橙幼胚组培植株高接后结果多年 经形态特征和生化鉴定 是 真正的杂种植株 黄仕周等 7 培养建水无籽蜜桔的幼胚 繁殖出大量的无性系苗 至今 已建立和完善了合子胚早期鉴别方法和离体培养技术 合子胚的早期离体培养技术应 用于杂交育种工作 可大大提高常规育种效率 2 1 1 2 体细胞杂种培育 1981 年 Vardi 等首次将柑桔原生质体培养成植株 并分别于 1986 年和 1987 年报 道了体细胞杂种植株和胞质杂种植株的获得 3 在种间体细胞杂交方面 邓秀新等 8 9 李峰等 10 和郭文武等 11 分别将粗柠檬 哈姆林甜橙 锦橙 红桔 宜昌橙 伏令夏橙 默科特桔橙 朋娜脐橙和诺瓦桔柚 纽荷尔脐橙 佩奇桔柚 粗柠檬等培养出再生植株 在属间体细胞杂交方面 邓秀新等 12 13 和甘霖等 14 15 分别将 Meiwa 金弹 伏令夏橙 佩 奇桔柚 九里香和伏令夏橙 枳橙培养出再生植株 邓秀新 16 将柑桔体 配融合试图一 步获得三倍体无核类型的研究 也取得了可喜的进展 用原生质体融合技术对柑桔果 3 树进行遗传改良 前景十分诱人 今后的研究应扩大融合组合 开展体 配融合和供 受体融合的非对称融合技术的研究 并对已获得的柑桔体细胞杂种进行深入研究 2 1 22 1 2 单倍体育种单倍体育种 柑桔类果树遗传上高度杂合 因而常规育种方法效率很低 而且由于育种周期长 用多代自交的方法获得纯系几乎是不可能的 花药培养获得单倍体植株后 经染色体 加倍 便可获得纯合二倍体 其中可能出现经济性状较为整齐和突出的个体 大大缩 短了育种周期 提高育种效率 此外 纯合二倍体用于杂交试验可更容易地进行优良 性状的遗传背景研究 花药培养已获得枳 Hidaka 1979 四季桔 陈振光 1980 橙 Hidaka 1982 柑 陈振光 1984 和甜橙 Hidaka 1984 的单倍体植株 但要进入 实际应用尚有不少问题需要解决 3 2 1 32 1 3 三倍体育种 无核育种 三倍体育种 无核育种 2 1 3 1 三倍体小粒种子及三倍体胚培养 研究发现 二倍体柑桔品种间人工杂交或自然授粉后 可产生容易与正常种子相 区别的三倍体小粒种子 它是由未经第二次减数分裂的 2X 雌配子与正常减数分裂的 X 雄配子受精产生 离体培养这些小粒种子 容易获得大量三倍体植株 因而可望在 较短时间内培育出三倍体无核品种 伊华林等 17 将本地早桔 哈姆林甜橙的三倍体幼 胚培养成功 抢救了合子胚 另外 利用异源四倍体体细胞杂种为父本进行杂交 获 得的三倍体是三亲杂种 后代将出现更为广泛的变异 有利于进一步选择优良类型 邓秀新等 18 照此方法杂交已培育出一批三倍体柑桔植株 随着异源四倍体体细胞杂种 的不断育成及已获得的体细胞杂种的陆续开花结果 将产生更多的三倍体后代 2 1 3 2 胚乳培养 胚乳是由两个极核细胞与一个精细胞结合后发育而成的三倍体组织 离体培养胚 乳可获得三倍体植株 进而产生无核果实 王大元等 19 首次成功地培养柑桔胚乳获得 三倍体植株 陈如珠等 20 和赵咏望等 21 分别将红江橙细胞形成中后期的胚乳诱导出愈 伤组织 并经胚状体和芽原基发育成植株 但是 由于胚乳培养难度较大 此项技术 尚需进一步完善 不少柑桔品种胚乳试管苗移栽成活十分困难 若进行田间嫁接 由 于二倍体砧木与三倍体茎芽不亲和 也较难成活 这也许是柑桔胚乳培养未实用化的 4 主要障碍之一 2 1 42 1 4 抗性育种抗性育种 由于离体培养较之于活体提供了一个更为一致和可控的系统 这为筛选和培育抗 逆性突变体开辟了一条新途径 王锋等 22 23 测定了 17 种 品种 柑桔愈伤组织的耐盐 性 并研究了枳 宜昌橙和桃叶橙等愈伤组织受盐胁迫的生理变化 陈立松 24 和胡一 东等 25 分别以本地早桔的胚性愈伤组织和柚汁胞的愈伤组织为材料 研究了各自的耐 盐性以及耐盐的生理生化变化 李显才等 26 用不同抗寒性品种枳 宜昌橙 遂川金柑 桃叶橙和尤力克柠檬等的愈伤组织进行冰冻处理试验 发现各品种的愈伤组织均对低 温敏感 且氨基酸含量变化与其抗寒性一致 表明愈伤组织作试材进行抗寒性研究是 有前途的 邓占鳌等 27 28 利用多种柑桔的愈伤组织采用射线和 EMS 诱变 筛选出耐盐 突变系 金忠恒 29 利用原生质体系统 获得了抗 NaCl 0 8 的甜橙突变体 并再生出 抗盐的柑桔类型 李卫等 30 31 研究了低温锻炼过程中柑桔原生质体抗冻性的变化以及 调节柑桔原生质体抗冻力的几种因素 指出原生质体抗寒性强弱可以作为柑桔抗寒育 种早期鉴定的指标 另外 李卫等 32 还将 Page 桔柚胚性愈伤组织分离的原生质体 用 软 X 射线辐射诱变 筛选出抗寒再生植株 彭昌操等 33 探讨了不同柑桔品种在高温胁 迫下细胞膜热稳定性和自由基清除剂在减轻或抵御高温下自由基伤害的作用 甘霖等 34 对 4 个体细胞杂种的抗寒 耐热和对脚腐病的抗性进行研究表明 橙类与枳杂种表 现出抗脚腐病 抗寒 14 耐热 52 矮化 半落叶 是极有希望的砧木新类 型 周长河等 35 对其它组合体细胞杂种进行了类似研究 初步分析了柑桔体细胞杂种 的抗性规律 结果表明体细胞杂种抗性介于双亲之间 Grosser J W 等 36 研究了通过体 细胞融合方法将亲本抗寒 抗病品性组合 得到新型抗性砧木 2 22 2 无病毒苗培养无病毒苗培养 病毒性病害是园艺植物培养的一大危害 患病植株长势衰弱 严重减产 品质变 劣 目前尚无有效的防治措施 柑桔衰退病曾经毁灭了巴西的大部分柑桔 圣保罗州 600 万株甜橙 占总数的 75 死亡 我国仅广东汕头地区于 1975 1977 年便因黄龙 病毁灭了 600 万株柑桔 37 不过植物不同部位带毒情况不同 茎尖小于 0 2mm 或经过 热处理后 较少带有病毒 因此 采用离体培养与嫁接结合的茎尖微芽嫁接技术可去 5 除病毒 培育出无病毒苗木 郭志勇 38 刘建雄等 39 宋瑞琳等 40 41 和姜玲等 42 分别将包括椪柑 温州蜜柑 脐橙 雪柑和枳橙等几十个品种成年树上的茎尖 通过微芽嫁接得到大量嫁接苗 经 病毒学鉴定 指示植物鉴定和多年田间观察 分别证明脱除了传染性杂色花叶病 裂 皮病 衰退病和黄龙病等病原体 随着微芽嫁接技术的推广 不少科技工作者积累了 丰富的经验 并对该技术进行了一些改进 张秋胜等 43 李隆华等 44 和漆巨贤等 45 分 别以脐橙 椪柑 夏橙和五布柚等 20 多个品种为试材 省去了茎尖微芽嫁接的一些程 序 既提高了成活率 又大大降低了培养脱毒苗的成本 谭祖国等 46 将朋娜和纽荷尔 脐橙的胚珠离体培养获得了无病毒珠心苗 2 32 3 离体种质保存离体种质保存 我国是柑桔类果树的起源中心 栽培历史悠久 具有十分丰富的种质资源 田间 种质资源保存需要花费大量的人力物力 种质材料易受病虫害或自然灾害而丢失 与 传统的田间保存方法相比 利用离体培养技术保存柑桔种质资源 具有省工 省地 简便 高效等特点 1977 年 Cameron 首次提出用组织培养技术保存柑桔种质 多年 来人们陆续探讨了各种材料的保存方法 使用的材料有 花粉 悬浮细胞 由愈伤组 织产生的胚状体和茎芽 种子 愈伤组织 胚珠 胚 体细胞胚 实生试管苗 茎段 等 47 采用的方法主要有抑制生长法和超低温保存法 抑制生长法是恶化培养环境使培养物保持最低量生长而达到保存目的 Fourie 48 将 种子实生苗在黑暗和 4 下保存一年后用作茎尖嫁接取得成功 权银等 49 和张进仁等 50 分 别以成年结果树的桂平朱砂桔 锦橙和红桔为试材 研究了温度 光照强度 甘露醇 和培养器皿封口材料对茎端和茎段 腋芽等外植体离体缓慢生长保存的影响 保存 1 年后的丛芽嫁接苗 经 PX 同工酶分析和染色体计数证明其遗传性是稳定的 伊华林等 51 发现 24 份不同种和品种的柑桔胚性愈伤组织继代周期和适宜的保存培养基有所不同 保存 13 年的锦橙胚性愈伤组织的染色体数有 99 以上没有变异 由胚状体再生的锦橙 植株形态 倍性也没有变异 因此 利用胚性愈伤组织可作为种质保存的一种辅助手 段 超低温保存是在液氮 196 下 使所有细胞都停止代谢活动 因而避免了遗传 变异 也为长期保存种质提供了可能 Sakai 等 52 Radhamanic 等 53 研究了解冻方法 6 与成活率的关系 王子成等 54 研究玻璃化法超低温保存柑桔茎尖和植株再生 以避免 愈伤组织变异带来不利影响 并对不同品种的再生能力进行了比较 王子成 55 对柑桔 原生质体的超低温保存研究发现玻璃化溶液加入小牛血清蛋白对原生质体的超低温保 存有利 并比较了不同倍性的茯苓夏橙原生质体经超低温保存后的存活率 2 42 4 组织形态学研究组织形态学研究 胡继金等 56 培养甜橙试管苗的完整叶片直接出芽 解剖观察发现 这种芽是由叶 脉微管束薄壁细胞或微管束附近的叶肉细胞分裂后直接分化而成 胡春根等 57 研究了 甜橙试管苗根发生移植及其与叶表面显微结构的关系 徐罕伦等 58 在培养柚的子叶切 块过程中 通过石蜡切片研究了柚的子叶细胞状态对其分化的影响 高峰等 59 60 对柑 桔胚珠培养中正常体细胞胚胎发生 异常体细胞胚胎发生 次生胚胎发生及器官发生 的过程和形态特征进行了系统的扫描电镜观察 张菊英等 61 提出了在扫描电镜下鉴别 双子叶植物胚状体和不定芽的形态依据 2 52 5 生理生化研究生理生化研究 由于酶在代谢中起着重要作用 其种类和活性跟植物发育阶段以及环境影响紧密 相关 可作为灵敏的生理生化指标 故目前生理生化的研究多结合酶学而展开 Kochba 等 62 研究发现 Shamoutic 胚珠来源的胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织在过氧化 物酶 POD 同工酶上存在着差异 朱世江等 63 64 研究了生长在培养基上的枳 红桔 和酸橙组培苗对 HCO3 的生理反应 并测定了培养液中不同浓度的 HCO3 及 Fe2 对根 系质子分泌的影响 黎众魁等 65 以芦柑子叶为外植体 对脱分化产生愈伤组织至再分 化产生器官的发育过程中过氧化物酶 POD 活性及同工酶谱变化研究时发现 再分 化过程的酶活性高于脱分化过程 根分化过程的酶活性高于芽分化过程 愈伤组织分 化出芽和根各有一条特征酶带 陈力耕等 66 用聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦研究珠心愈伤 组织胚发生早期过氧化物酶 POD 同工酶的表达 发现球形胚及球形胚形成前 10 天 的培养物都存在一个分化培养前的胚性愈伤组织所没有的酸性 POD 同工酶 该同工酶 可作为胚胎发生早期的生化标记 薛妙男等 67 分析了沙田柚花粉在发育过程中过氧化 物酶 POD 淀粉酶 AMY 酯酶 EST 同工酶的活力及类型的变化 可作 为花粉发育各时期的生化指标 李红艳等 68 分析了 POD EST AMY 同工酶类型的变 7 化与沙田柚花柱发育各个时期的关系 王任翔等 69 研究酸柚离体培养根分化过程中内 源 IAA 和 POD 同工酶的测定结果表明 同工酶酶谱的变化早于肉眼可见的根分化的形 态学变化 可作为酸柚离体培养根分化过程中内源 IAA 变化及根分化合适的早期生化 指标 Consuelo Monerri 等 70 对 satsuma mandarin 未开花和花期的芽和叶进行同工酶比 较 发现虽然花期叶的 POD 活性比未开花的叶高 但不能作为有效的指标 伍玲等 71 考察了 HCO3 和 pH 对酸橙 红桔和枳的悬浮培养细胞 团 的生理效应 测定了过氧 化物酶 POD 过氧化氢酶 CAT 及质膜透性等生理指标 Yardena Gueta Dahan 等 72 研究了盐胁迫条件下柑桔超氧化物歧化酶 SOD 和抗坏血酸氧化酶 APX 的变 化 比较了盐胁迫和氧胁迫条件下生理变化的相似与不同 2 62 6 柑桔基因工程柑桔基因工程 70 年代后期 在植物分子生物学和离体培养技术发展的基础上 出现了一个全新 的研究领域 植物基因工程 基因工程提供了从分子水平直接进行遗传操作 定向 改造植物性状的手段 这项技术目前已成为全世界普遍关注的 用以改良植物性状 创造植物新种质的有效途径 由于柑橘原生质体培养体系较为成熟 所以最先运用这种方法进行基因转移的研 究 Kobayashi 等 73 采用 PEG 法 以柑橘品种 Trovitaorange 为试材 获得了转化的胚 性愈伤组织 但没有获得再生植株 Vardi 74 运用同样的方法转化粗柠檬原生质体 获 得了 2 株转基因植株 Fleming 等 75 用 PEG 法将绿色荧光蛋白基因导入甜橙 并获得 了转化植株 王锋等 76 通过 PEG 法及转化脂介导法将不同调控序列控制下的 Gus 基因 导入柑桔原生质体中 研究了 Gus 基因在柑桔原生质体中的瞬间表达情况 直接导入 法较为简便 但是由于对原生质体伤害较重 再生不易 使其应用受到限制 但在柑 橘的某些品种或类型的遗传转化上具有一定的优势 农杆菌介导法是以农杆菌中的 Ti 质粒 根癌农杆菌 或 Ri 质粒 发根农杆菌 为基因载体 将外源基因整合到植物细胞的染色体 DNA 上 从而实现基因的转移 绝 大多数柑橘品种都对农杆菌比较敏感 因此 农杆菌介导成为柑橘遗传转化的主要方 法 高峰等 77 在国内首先利用根癌农杆菌感染椪柑 红桔的叶片和胚轴 将激素合成 酶基因和章鱼碱基因转入柑橘并得以表达 Hidaka 等 78 以含有标记基因 Npt 基因和 Htp 基因的质粒载体的农杆菌感染几个品种的悬浮培养细胞 并再生转基因植株 唐岱 8 等 79 和李名扬等 80 用发根农杆菌感染实美橙和甜橙的子叶 通过在无激素培养基中的 生长以及电泳检测证明 Ri 质粒 T DNA 已转移并整合到子叶细胞核基因组中并得到表 达 Moor 等 81 和李卫等 82 又发展了一种更直接 简化的方法 采用农杆菌介导转化节 间茎段 通过再生芽而获得了转基因植株 此法不仅适用于柑桔 而且为类似柑桔生 长特征的大多数果树的遗传转化提供了一条新途径 陈善春等 83 85 以含有双元载体 携带人工合成的柞蛋抗菌肽 D 基因 Npt II 基因和 Nos 基因 的根癌农杆菌菌株 SE 转化锦橙 新会橙 沙田柚的上胚轴和子叶外植体 经共培养和预培养后在含卡那 霉素 Km 的诱芽培养基中诱导并筛选 Km 抗性芽 探明了柑桔品种 基因型 预 培养时间和不同的芽伸长培养基对 Km 抗性芽诱导和伸长的影响 抗性芽经伸长培养 后在含 Km 的生根培养基中生根或经离体微嫁接 获得了转化植株 目前 他们正着 手研究转移 Cecropin B 和 Shiva A 基因控制柑桔溃疡病的基因工程 另外 人们试图通过直接转化成年态材料的方法 获得成年态的转基因植株 从 而加速育种进程 Cervera 等 86 报道了他们在这方面的研究结果 他们首先用离体嫁接 的方法 建立起甜橙成年态外植体离体再生体系 解决了成年态柑橘材料难以分化生 根的问题 然后 将外源基因通过农杆菌介导法转入离体培养的成年态柑橘材料 这 些转基因植株在 14 个月后开花并结果 该方法为柑橘遗传转化开辟了一条很有前途的 途径 如果在其它柑橘品种或类型上能够推广 必将加速育种的进程 3 3 问题与展望问题与展望 柑桔的组织培养研究几十年来开展得比较广泛 但真正能大规模投入实际应用的 还不多 目前在胚培养和茎尖微嫁接方面应用较多 而其他方面如胚乳培养 花药培 养 体细胞杂交上都还有很多问题需要解决 基础理论研究 特别是器官分化过程的 生理生化变化以及分化的分子生物学机制没有系统地开展研究 进一步的深化研究必 将推动技术的实用化进程 4 4 本研究的意义本研究的意义 金桔是江西遂川有名的土特产品 既营养丰富 又有较多的医疗用途 还是优秀 的园艺及盆景观赏植物 具有很大的开发利用价值 因金桔果实内种子较少 枝条扦 插不易生根 其繁殖方式主要采用嫁接手段 生产季节性强 限制了良种的发展 再 9 者 长期嫁接育种会导致病毒积累 影响果实品质 传统的繁育方式在金桔良种扩繁 和品种改良上已显现不足 如何利用组织培养技术对金桔的进行良种扩繁和新品种选 育具有重大的意义 有关金桔的组织培养研究 到目前为止开展得不多 黄纯真等 87 对金桔嫩枝侧芽 进行培养 贾勇炯等 88 用金桔无菌苗的下胚轴 子叶 幼叶及幼根进行培养 比较了 不同外植体诱导和分化的难易程度 贺忠群等 89 研究发现激素对金桔种胚萌发有抑制 作用 坚直放置对上胚轴诱导和分化不利 在体细胞杂交方面 邓秀新等 12 史永忠 等 90 Grosser J W 等 91 Ollitrault 等 92 Miranda 等 93 分别获得金柑与 Valencia 甜 橙 Succari 甜橙 Mediterranean mandarin trifoliate orange 的属间杂种 但是 这些 杂种的生长表现出不正常 可能由核质不相容所导致 本研究以金桔上胚轴为外植体 研究愈伤组织诱导和分化培养的适宜条件 建立 简便有效的离体培养再生体系 在此基础上 详细观察金桔上胚轴离体培养过程中组 织形态的变化 并探讨几种同工酶及可溶性蛋白含量变化与愈伤组织诱导和分化过程 中形态发生的相互关系 可为金桔离体器官发生过程的生理生化研究提供一定参考 同时为金桔良种繁育和工厂化生产提供一些理论依据 10 材料与方法材料与方法 1 1 材料材料 金桔 Fortunella margarita Lour Swingle 的成熟果实由遂川县科委提供 取出金 桔种子 先用自来水洗去外附汁胞和粘液 晾干 小心去除外种皮 以利于萌发 依 次经 70 酒精 30s 0 1 HgCl2 10min 消毒 用无菌水冲洗 4 次 然后接种到不含激 素的 MS 培养基上培养 温度 26 2 光照时间 12 h d 光照强度 1000 lx 当苗长到 约 2cm 时 三周左右 即取上胚轴 2 2 方法方法 2 12 1 金桔上胚轴离体培养再生体系的建立金桔上胚轴离体培养再生体系的建立 2 1 12 1 1 愈伤组织的诱导愈伤组织的诱导 采用三因素三水平正交试验研究 6 BA NAA 和蔗糖对愈伤组织诱导的影响 方 案见表 1 和表 2 MS 基本培养基附加 0 7 琼脂 500mg L 水解酪蛋白 0 1 活性炭 pH5 8 采用高压蒸汽灭菌 121 保温 20min 培养条件 温度 26 2 光照时间 12 h d 光照强度 1000 Lx 将上胚轴切为 0 5cm 小段 接入表 2 培养基进行诱导培养 每瓶培养基接种上胚 轴 7 8 个 每种培养基重复 8 瓶 观察愈伤组织的形态发生和生长情况 并在第 24d 测定愈伤组织的增长量 倍数 愈伤组织增长量 倍数 诱导 24d 外植体重量 诱导前外植体重量 表 1 正交试验因素水平表 Table 1 Levels of orthogonal experiment factors 11 水平6 BA mg L NAA mg L 蔗糖 1 2 3 1 0 1 5 2 0 0 0 5 1 0 3 4 5 表 2 正交试验表 Table 2 Orthogonal layout of experiment 编号6 BA NAA 蔗糖e 拟因子 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 1 2 2 2 3 3 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 3 2 2 1 3 3 2 1 1 2 3 2 3 1 3 1 2 2 1 22 1 2 愈伤组织的分化愈伤组织的分化 将最佳诱导效果培养基上得到的愈伤组织 转至附加不同浓度 6 BA 和 NAA 的 MS 培养基 表 3 进行分化培养 每瓶培养基接种愈伤组织 6 7 块 每种培养基重复 8 瓶 40d 后统计分化率和出芽数 MS 基本培养基附加蔗糖 5 其余附加成分同 2 1 1 培养条件 温度 26 2 光照时间 14 h d 光照强度 1500 Lx 表 3 愈伤组织分化培养基 Table 3 Mediums for callus induction 编号6 BA mg L NAA mg L 1 2 3 4 5 6 7 8 1 5 1 5 1 5 1 5 2 0 2 0 2 0 2 0 0 0 25 0 5 1 0 0 0 25 0 5 1 0 12 2 1 32 1 3 生根培养生根培养 当新芽长到 2cm 左右时从愈伤组织块上切下 转入附加不同浓度 NAA 0 0 5 1 0mg L 的 MS 和 1 2MS 培养基诱导生根 观察生根情况 MS 和 1 2MS 基本培养基附加 0 7 琼脂 4 蔗糖和 0 1 活性炭 pH5 8 培养条件同 2 1 2 2 22 2 离体培养过程中解剖学观察离体培养过程中解剖学观察 2 2 12 2 1 愈伤组织诱导过程的解剖学观察愈伤组织诱导过程的解剖学观察 取不同诱导时期 0d 2d 4d 6d 12d 18d 24d 的上胚轴按表 4 的步骤进行 石蜡切片制作 2 2 22 2 2 愈伤组织分化过程的解剖学观察愈伤组织分化过程的解剖学观察 取不同分化时期 4d 8d 12d 18d 24d 30d 36d 的愈伤组织 具体步骤同 表 4 石蜡包埋后保存于 4 冰箱 以后统一进行修块 切片和制片 94 表 4 石蜡切片制作步骤 Table 4 Steps of paraffin slice making 步骤备注 固定 真空抽气 脱硅 自来水冲洗 番红块染 脱水 透明 透蜡 包埋 修块 切片 展片 烘片 制片 镜检拍照 FAA 70 酒精 90ml 冰醋酸 5ml 甲醛 5ml 固定一天 直至无气泡 材料沉底 15 氢氟酸浸泡一周 1d 1 克番红溶于 100ml 70 酒精 70 80 90 95 95 100 100 酒精 每级 25 30min 二甲苯两次 直至材料透明 25 50 75 100 100 100 石蜡 每级 25 30min 纯蜡包埋于方纸盒 切面朝下 粘于小方木块上 修平整 切片厚度 10 m 水温控制 42 45 50 烘箱中 2 3 天 脱蜡 复水 番红染色 脱水 固绿染色 二甲苯分色 中性树胶封片 Olympus PM 10AD 显微镜 13 2 32 3 离体培养过程中同工酶变化离体培养过程中同工酶变化 2 3 12 3 1 酶样的制备酶样的制备 2 3 1 1 愈伤组织诱导阶段 取不同诱导时期 0d 1d 2d 4d 6d 12d 18d 24d 的上胚轴 按材料与研 磨 PBS 缓冲液 1 8 W V 的比例 置冰浴研磨 4 下 12000 r min 离心 15min 取 上清液与 50 甘油按 4 1 V V 混合 50 l 分装于小离心管后 置 20 低温冰箱保 存 统一进行电泳 2 3 1 2 愈伤组织分化阶段 取分化培养不同时期 1d 2d 4d 6d 12d 24d 30d 36d 的愈伤组织 处 理同 2 3 1 1 研磨缓冲液 0 01mol L 磷酸缓冲液 PBS pH7 3 附加 0 07 W V 半胱氨酸 Cys 0 1 W V 抗坏血酸 Vc 0 2 W V 乙二胺四乙酸二钠 EDTA Na 0 5 W V 聚乙烯吡咯啉酮 PVP 2 3 2 2 3 2 电泳贮液配制电泳贮液配制 30 Acry 0 8 Bis 1M Tris HCl pH 8 8 1M Tris HCl pH 6 8 0 128M Tris 柠檬酸 pH 8 9 0 128M Tris 柠檬酸 pH 6 8 1 过硫酸铵等贮液配制参照何忠效 95 贮液置 4 冰箱中保存 2 3 32 3 3 电泳电泳 采用垂直板不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 电泳前自然解冻 再次 4 下 12000 rpm 离心 10min 取上清液 加少许溴酚蓝 2 混匀作前沿指示剂 上样 40 l 进行电 泳 起始电压 200V 指示剂进入分离胶后 电压升至 250V 电泳在 4 冰箱内进行 时间约 2 5h 2 3 3 1 过氧化物酶 POD 的制胶和染色 分离胶为 0 65mol L Tris HCl pH8 8 T 7 5 C 2 6 浓缩胶为 0 125mol L Tris HCl pH6 8 T 3 C 2 6 电极缓冲液 20 141 1 克甘氨酸和 30 克 Tris 用蒸 14 馏水溶解定容至 1L pH8 3 制胶按表 5 染色采用改良联苯胺法 称取 0 8 克联苯胺 用 6ml 冰醋酸 60 溶解 再加入 34ml 水配成联苯胺溶液 随用随配 然后按下列比例配制染色反应液 联苯胺溶液 4 氯 化铵溶液 5 EDTA Na 溶液 0 3 H2O2溶液 蒸馏水 1 1 1 1 9 用蒸馏水将电泳后的胶板冲洗 1 2 次 浸于染色液中来回振荡 5 10min 出现酶带 后弃去染色液 用自来水冲洗 每天换水 3 次 2 3d 后 酶带由蓝色变为棕色 表 5 POD